RCAN1在外周血管疾病中作用的研究進展

李 波，謝 銳 綜述，張承圣 審校(重慶市巴南區人民醫院，重慶 401320)

鈣調神經磷酸酶(Calcineurin，CN)又稱蛋白磷酸酶2B(PP2B)，是一種鈣調素(Calmodulin，CaM)依賴重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，其在細胞信號傳遞過程中直接受細胞內 Ca2+濃度的調節。活化的CN通過對下游NFAT、tau、CREB、BAD等底物去磷酸化作用[1]，參與心肌肥大、細胞凋亡、突觸的可塑性以及記憶功能等多種信號活動的調節。鈣調神經磷酸酶A亞基(Calcineurin A，CaN)外源性抑制劑如環孢菌素A(Cyclosporin A，CsA)、他克莫司(Tacrolimus，FK506)等通過抑制CN/NFATc信號通路在治療CaN相關炎性反應及免疫相關疾病中具有重要作用。由于CN 外源性抑制劑對各器官組織的 CN 無選擇性，全身應用不良反應較大，其內源性調節因子RCAN1近來研究受到逐漸重視。近年來研究發現RCAN1在血管平滑肌細胞增殖、血管生成、動脈粥樣硬化形成，血管內膜增生等過程中發揮著一定調節作用。RCAN1及其通路在血管疾病領域研究的闡明有望為血管疾病治療提供新的策略。

1RCAN1分子結構

RCAN1基因亦稱作唐氏綜合征關鍵區域1基因(Down Syndrome Critical Region 1 gene,DSCR1),是阿爾茨海默病和唐氏綜合征等相關疾病發病機制中起著關鍵作用的基因[2]。RCAN1基因包含7個外顯子，其中外顯子1-4均可替代第一外顯子選擇性剪切產生RCAN1-1、RCAN1-2、RCAN1-4等3種不同的mRNA 轉錄產物，外顯子5-7在上述轉錄產物中均有表達[3]。RCAN1亞型表現形式及轉錄機制各不相同，外顯子2在胎兒的腦和肝中表達，外顯子1和外顯子4在胎兒的腦組織、肝組織、腎及成人的大多組織中表達且表達存在差異[4]。RCAN1-1和RCAN1-4是主要的轉錄產物亞型。RCAN1亞型的不同表現形式與不同的轉錄機制有關RCAN1-1在許多組織中存在表達，在受到刺激及CN/NFAT信號通路激活后，RCAN1-4才開始轉錄。RCAN1-4可通過與CN和GATA信號通路調節，而RCAN1 1通過Notch和Hes-1相關的信號通路調節[5]。RCAN1內源性調節CN作用可能與RCAN1磷酸化狀態有關，如細胞外信號調節激酶(ERK)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Dyrk1A、TGFβ激活的蛋白激酶1(TAK1)、NF-kB誘導激酶(NIK)。PKA[6]等通過RCAN1 的Ser 93，Ser 108，Ser 112，Thr 124，Thr 153等不同位點參與RCAN1磷酸化調節。RCAN1蛋白可通過泛素-蛋白酶體系統和溶酶體自噬通路降解，FBW7、FBXW1、Nedd4-2、STAT2、USP22等因子可通過泛素化RCAN1參與RCAN1蛋白水平的調節，從而影響RCAN1相關的病理生理過程調節[7]。

2RCAN1的作用機制

目前研究認為RCAN1是CN的一種內源性調節因子，RCAN1通過其外顯子PxIxxT結構域與鈣調神經磷酸酶亞基A相互結合，通過調節CnA信號通路相關的多種病理生理。CN 在組織中分布廣泛，其在心血管系統中、神經系統中、運動系統及腫瘤等多個系統中發揮著生物學效應。 CN是一個由催化亞單位(CnA) 和調節亞單位(CnB) 組成的二聚體結構，其在體內鈣、鈣調節蛋白濃度增加后與CN 結合后進而誘發CnA 構象的改變，致使自身抑制或移位，暴露出活性位點，導致CN活化，活化的CN通過下游活化的T細胞因子(NFAT)去磷酸化而發揮生物學效應。研究報道RCAN1對CN調節起雙重作用，一方面RCAN1對CN具有抑制作用，RCAN1可通過抑制CN/NFAT信號通路參與多種病理生理過程；另一方面RCAN1可活化CN信號通路，其可能與RCAN1磷酸化有關。RCAN1 的保守區域SP 被糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)磷酸化[8]，RCAN1降解，激活CN，活化的CN通過對下游產物NFAT、tau、CREB、BAD等去磷酸化；去磷酸化的底物轉位入核，參與多種基因的調控，參與多種疾病的病理生理過程。

3RCAN1在血管領域研究進展

3.1RCAN1在炎性反應中的作用：炎性反應與免疫反應是多種心臟及血管疾病的發病基礎，炎性反應的發生與多種信號通路有關，近些年來研究顯示RCAN1通過NFAT通路與NF-KB通路在炎性反應通路中具有重要作用[9]。一方面RCAN1通過與CN結合、抑制NFAT底物磷酸化及NFAT轉位入核、從而抑制了NFAT調節的下游基因轉錄，進而對T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞及巨噬細胞等免疫細胞誘導產生的IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，TNF,GM-CSF 多種炎性因子調控，參與炎性反應調節[10-11],另一方面RCAN1通過與IkBa相互作用，減少了IkBa磷酸化，增加了其穩定性，抑制NF-kB信號通路進而參與炎性因子轉錄相關基因的調控[12]。Takashi等對臍靜脈內皮細胞DNA微陣列分析發現過量表達的NFAT可上調51個與凝血酶誘導內皮細胞相關的基因；RCAN1過表達可促使凝血酶誘導的內皮細胞基因下調三分之一，其中包括VCAM-1基因，進一步說明RCAN1通過NFAT通路上調炎癥因子表達。此外Yuan等研究顯示RCAN1調節炎性反應與MicroRNA-34a有關[13]，在人臍靜脈內皮細胞培養中發現MicroRNA-34a轉錄增加，可導致RCAN1表達水平增加，NFATC1及nfkb水平也顯著增加。但研究發現RCAN1對炎癥具有抑制作用，Junkins等通過對呼吸道感染炎性反應模型研究提出RCAN1對炎性反應具有抑制作用，并推測其可能與STAT3通路與炎癥調節有關[14]。張小鴻等研究發現，在氧化應激導致[15]。細胞凋亡時，RCAN1的過表達可對氧化應激所導致 細胞凋亡具有一定程度的保護作用，并推測RCAN1 其可能負向調節NLRP3炎性相關的信號通路活化信號，抑制 IL -1β等炎性因子產生。但Peters等對RCAN1在牙周炎疾病中研究發現[16]，牙周內皮細胞研發現在牙周內皮細胞慢性炎性反應時RCAN1表達受到抑制，而在急性炎性反應時RCAN1表達上調，其可能RCAN1對炎性反應調節與細胞、組織的種類，不同刺激及疾病的進展程度及其他信號通路參與調節有關。

3.2RCAN1在血管內皮細胞中的作用：血管內皮細胞是覆蓋于血管腔組織表面的一層單層細胞，在維持血管滲透性、傳遞血管信息交換及分泌調節血管活性相關物質等方面起關鍵作用。內皮細胞活化或缺失在動脈粥樣硬化、炎性反應、血管生長及腫瘤生長等病理過程中起著重要作用[17]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種潛在的促血管生成調節因子，其在缺氧或在炎性反應刺激下分泌[18]。研究示RCAN1在臍靜脈、人主動脈、人皮膚微血管及人視網膜等血管的內皮細胞均有表達，在VEGF刺激下RCAN1.4表達上調；RCAN1基因敲出后，在VEGF刺激作用體外內皮細胞遷移明顯受到抑制，其病理機制可能與RCAN1與CN/NFAT信號通路負反饋調節有關。Ahmad等研究認為，RCAN1調節血管內皮細胞還可能與調節有關，RCAN1通過CN/NFAT信號通路和PKC信號通路調節RCAN1.4表達，進而促進內皮細胞遷移[19]。此外Li等在低氧誘導臍靜脈內皮細胞凋亡研究發現RCAN1-L過表達明顯降低了線粒體質量[18]，減少去極化線粒體，下調ATP和活性氧的產生，通過刺激線粒體細胞發生自噬反應，進而調節細胞的凋亡，此外研究認為RCAN1參與細胞氧化應激所導致損傷調節可能與氧化應激創傷導致RCAN1過表達，進而抑制CN活性有關。另有研究顯示，RCAN1可通過下調一氧化氮合成酶(nitric oxide endothelial synthase，eNOS) 活性，促使體內NO的濃度降低，進而引起內皮功能障礙等相關疾病[20]。

3.3RCAN1在血管生成中的作用：新生血管生成是胚胎發育、器官生長，組織修復必不可少的生理過程，近年來研究顯示RCAN1在血管生成調節中具有重要的調節。血管內皮生長因子(VEGF)及VEGF的受體被認為是當前在調節血管生成生理及病理過程中的一個重要調節物質。當前研究發現CN/NFATc信號通路的活化可具有促進VEGF所誘導的血管生成作用[21]，其可能與VEGF及VEGF 2受體(VEGF-2)與血管內皮的細胞結合同時并通過CN/NFAT信號通路活化轉錄Cox-2等血管生成基因進而參與血管的生成調節[22]。此外在動物模型中研究發現，在使用CsA處理后VEGF誘導的血管生成顯著減少。RCAN1為CN內源性調節因子，其可能參與血管生成的調節過程。 Mayumi等通過對臍靜脈內皮細胞cDNA芯片對7267人類基因分析鑒定VEGF誘導血管生成和血管通透性基因研究發現RCAN1是其中一個高誘導的基因[23]。Jimin等在小鼠肺部腫瘤模型中研究發現RCAN1可通過抑制CN活性從而對腫瘤組織血管生成的調節起著抑制作用[24]。在體外實驗中RCAN1過表達可明顯減少內皮細胞增殖，但RCAN1.4基因敲出后內皮細胞增殖明顯加快，此外Qin研究發現在VEGF誘導下RCAN1-1可誘導血管生成，而RCAN1.4對血管生成卻有抑制作用[25]，表明RCAN1對血管調節可能與其亞型有關。 Masakazu等通過對臍靜脈血管RCAN1表達研究發現RCAN1在管腔大分支少的組織中表達顯著高于分支多管腔小的血管組織[26]；在體內研究發現，蟾受精卵內注射RCAN1 mRNA，RCAN1過表達組蟾肌節間的血管分支明顯減少，提示RCAN1可能與不同大小血管組織的生成中起著不同調節作用。

3.4RCAN1在血管平滑肌增殖中的作用：血管平滑肌細胞(VSMC)具有維持血管的完整性和穩態功能，VSMC表型轉變、異常增殖、凋亡以及細胞外間質成分組成改變進而引起的血管組織重塑是血管動脈瘤、血管支架植入術后再狹窄及新生動脈粥樣硬化等多種心血管疾病發生及發展中重要病理基礎[27]。平滑肌增殖與多種信號通路有關，既往研究顯示Ca2+/CaM-CN-NFAT信號通路激活對VSMC增殖信號轉導中發揮著重要促進作用，研究發現G蛋白偶聯受體激動劑、酪氨酸蛋白激酶受體激動劑等在不同因子刺激作用下，通過NFATc去磷酸化轉位入核，調節多種活性因子及促VSMC增殖相關基因轉錄，調節VSMC增殖和遷移[28]。在小鼠的球囊損傷模型中，在球囊擴張術后其動脈管腔的狹窄與 CaN 信號通路活化有關[29]，使用鈣調神經蛋白的外源抑制劑CsA明顯減輕球囊損傷造成的血管狹窄[30]。RCAN1對CN/NFAT信號通路起著關鍵的調節作用，RCAN1可能通過該信號通路的調節進而參與VSMC調節。血管緊張素Ⅱ已經被證明是誘導VSMC增殖活性分子，全基因組分析顯示> 1500基因與血管緊張素II誘導VSMC有關，其中與CN活性有關有11個基因，而RCAN1基因與CN活性最為密切，提示RCAN1可能參與VSMC調節；Esteban等研究發現RCAN1在血管緊張素Ⅱ(AngII)誘導的VSMC增殖起著著重要的作用，在AngⅡ誘導下，RCAN1基因敲出后小鼠VSMC增殖明顯低于對照組，在體外細胞實驗中也證實RCAN1對AngⅡ誘導VSMC增殖具有一定的促進作用[31]，但目前在人體血管VSMC增殖還未明確。Monica Y等指出RCAN1通過損傷誘導VSMC表型轉換調節，其通過對CN/NFAT通路反饋調節有關[32]。

3.5RCAN1在動脈粥樣硬化中的作用：動脈粥樣硬化是造成心肌缺血、腦卒中及外周血管閉塞疾病主要原因。當前研究認為RCAN1蛋白在血管動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)早期的形成過程里可能具有促進作用。研究顯示RCAN1是一種潛在的致AS因子，Nerea等通過人體冠狀動脈AS的斑塊分析發現RCAN1在有AS斑塊的冠狀動脈組織中顯著高于非動脈粥樣硬化冠狀動脈[33]。其在小鼠動脈組織AS模型中觀察發現RCAN1在高脂飲食組表達高于正常飲食組，RCAN1基因敲出組其斑塊面積及內膜與中膜比顯著要低于對照組，提示抑制RCAN1表達可能對延緩AS進程有關。此外，炎性反應也是導致動脈粥樣硬化進展的一個必不可少因素，研究顯示RCAN1能夠抑制NF-KB活性，且可參與炎癥的調節。此外研究顯示使用CsA藥物可抑制RCAN1-CN-NFAT信號通路，降低動脈粥樣硬化進展及維持血管的完整性[34]。氧化低密度脂蛋(oxLDL)和巨噬細胞吞噬作用是導致動脈粥樣硬化主要原因，RCAN1調控oxLDL機制目前還不清楚，還有待于進一步研究。

4 展望

隨著我國逐步進入老齡化社會，血管疾病已逐漸成為導致人們健康的主要疾病。血管炎性反應、動脈粥樣硬化、平滑肌增殖等作為心血管疾病共同病理基礎，有效的治療和預防對控制和延緩疾病的發生、發展具有重要的意義。RCAN1在血管組織的內皮細胞、VSMC的增殖、血管的生成、動脈粥樣硬化的形成、炎癥及血管的功能方面發揮著重要作用,對臨床介入術后支架內再狹窄、動脈硬化、動脈瘤等血管疾病及腫瘤的治療和預防提供新的途徑。目前RCAN1與血管疾病研究不多，基礎研究大多局限于動物和細胞實驗，RCAN1與人體血管疾病的研究還不是很清楚，RCAN1是否通過CN/NFATc信號通路或與其他信號通路共同參與血管疾病調節及相關調節機制還有待于進一步探討研究。

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