沉默長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

劉泓鍵，奉友剛，余周，康永明，賀煒，姜明東

(遂寧市中心醫(yī)院,四川遂寧629000)

膀胱癌是最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，以膀胱移行性細(xì)胞癌最常見(jiàn)[1]。膀胱移行性細(xì)胞癌具有易侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等生物學(xué)特性，但目前對(duì)膀胱癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt，位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，因缺乏開(kāi)放閱讀框架而無(wú)法編碼蛋白質(zhì)。研究認(rèn)為，LncRNA與物種進(jìn)化、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝以及腫瘤發(fā)生等有關(guān)[2]。LncRNA可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平等參與染色體的修飾、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程[3]。HOTAIR是一個(gè)長(zhǎng)2 158 nt的反義LncRNA，其反式調(diào)控位點(diǎn)不在染色體的HOX基因簇，因而無(wú)法調(diào)控編碼該LncRNA自身的HOX基因簇[4]。HOTAIR一直被認(rèn)為是一種原癌基因，在多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，與腫瘤的發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)[5]。HOTAIR可作為多梳抑制復(fù)合體2與組蛋白去甲基化酶的分子支架，通過(guò)調(diào)控組蛋白H3K27甲基化和H3K4去甲基化水平，使腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因表達(dá)沉默，同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移正向調(diào)控基因表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[6]。Notch信號(hào)通路蛋白1(Notch1)、上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)、趨化因子受體2(CXCR2)、上皮性黏附蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)基因與細(xì)胞增殖、凋亡等密切相關(guān)。目前，關(guān)于HOTAIR對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡影響的報(bào)道較少。2017年5月～2018年3月，我們觀察了沉默LncRNA HOTAIR對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌253J細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。DMEM，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；FBS，以色列BI公司；si-HOTAIR(可沉默HOTAIR表達(dá))及空載體陰性序列(Vector)均由上海生工生物工程股份有限公司合成，si-HOTAIR序列上游引物5′-GATCCGCCTTTG-GAAGCTCTTGAAGGCTCGAGCCTTCAAGAGCTTCC-AAAGGCTTTTTG-3′，下游引物5′-AATTCAAAAAGC-CTTTGGAAGCTCTTGAAGGCTCGAGCCTTCAAGAG-CTTCCAAAGGCG-3′；Vector上游引物5′-GATCC-TTCTCCGAACGTGTCACGTAATTCAAGAGATTACGT-GACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′，下游引物5′-A-ATTCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCT-TGAATTACGTGACACGTTCGGAGAAG-3′。TRIzon Reagent、Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光定量PCR儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞分組及si-HOTAIR干擾方法 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期253J細(xì)胞，隨機(jī)分為si-HOTAIR干擾組、空載體組、對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%時(shí)，si-HOTAIR干擾組、空載體組分別轉(zhuǎn)染si-HOTAIR、Vector，對(duì)照組不做任何處理，然后將各組細(xì)胞放回孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4 h更換為含血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。取各組轉(zhuǎn)染4 h細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，每孔加入新配制的CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值。以O(shè)D450值代表細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用Hoechst法。取各組轉(zhuǎn)染4 h細(xì)胞，固定，Hoechst 33258染色液染色5 min。充分混勻，振蕩洗滌，于載玻片上加入相應(yīng)的抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取各組轉(zhuǎn)染4 h細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA,RQ1 RNase-Free DNase去除基因組DNA，NanoDrop2000檢測(cè)RNA濃度。根據(jù)Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit建立20 μL反應(yīng)體系，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。嚴(yán)格按照SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：Notch1上游引物5′-CTTTGTGCTTCTGTTCTTCGTG-3′，下游引物5′-CGCCGCTTCTTCTTGCT-3′；EpCAM上游引物5′-TTCGGGCTTCTGCTTGC-3′，下游引物5′-CCCTTCAGGTTTTGCTCTTC-3′；CXCR2上游引物5′-ATGTCTCAGCATCTGGGGTCT-3′，下游引物5′-GCAGGGTGAATCCGTAGCA-3′；E-cadherin上游引物5′-ATCTGAAAGCGGCTGATACTG-3′；下游引物5′-TGCCCCATTCGTTCAAGTA-3′；MMP-2上游引物5′-CCGCAGTGACGGAAAGA-3′，下游引物5′-TGGTGTAGGTGTAAATGGGTG-3′；Vimentin 上游引物5′-TCGTGATGCTGAGAAGTTTCG-3′，下游引物5′-TCTGGATTCACTCCCTCTGGT-3′；α-SMA上游引物5′-GCGTGGCTATTCCTTCGT-3′，下游引物5′-TCAGGCAACTCGTAACTCTTCT-3′；GAPDH上游引物5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下游引物5′-GAGAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。反應(yīng)體系：RNase Free dH2O 9.5 μL，cDNA/DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算HOTAIR、Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 轉(zhuǎn)染4 h，si-HOTAIR干擾組、空載體組、對(duì)照組細(xì)胞增殖能力分別為0.38±0.02、0.89±0.01、0.89±0.02。與對(duì)照組、空載體組比較，si-HOTAIR組細(xì)胞增殖能力明顯下降(P均<0.05)，而對(duì)照組與空載體組比較P>0.05。

2.2 各組凋亡細(xì)胞數(shù)比較 轉(zhuǎn)染4 h，si-HOTAIR干擾組、空載體組、對(duì)照組凋亡細(xì)胞數(shù)分別為(33.56±2.26)、(13.69±1.25)、(12.85±1.35)個(gè)。與對(duì)照組、空載體組比較，si-HOTAIR組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯升高(P均<0.05)，而對(duì)照組與空載體組比較P>0.05。

2.3 各組細(xì)胞Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空載體組比較，#P<0.05。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有易侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等生物學(xué)特性，但其病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。

HTOAIR是一種由2 158個(gè)堿基組成的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，是一種原癌基因，在多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，與腫瘤的發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。Gupta等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HTOAIR與多梳抑制復(fù)合體2結(jié)合，可誘導(dǎo)H3組蛋白的第27位賴氨酸甲基化，造成JAM2、PCDH10和PCDHB5等腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因在表觀遺傳水平上達(dá)到基因沉默的效果。Wu等[8]觀察HOTAIR與腎癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，隨HOTAIR表達(dá)增加，腎癌細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，p16、p21、p53等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)異常；進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，裸鼠腫瘤重量亦顯著增加；基因芯片檢測(cè)表明，敲除HOTAIR基因可減弱HOTAIR招募H3K27me3后結(jié)合蛋白的能力。Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR高表達(dá)與肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)以及肝癌細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、空載體組比較，si-HOTAIR組細(xì)胞增殖能力明顯下降，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯升高，說(shuō)明下調(diào)HOTAIR表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

Notch基因在各種生物體內(nèi)廣泛存在，并具有高度同源性[10]。Notch及其相關(guān)基因在進(jìn)化上高度保守，在細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、空載體組比較，si-HOTAIR組Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，說(shuō)明HOTAIR可能通過(guò)影響Notch1表達(dá)影響細(xì)胞凋亡。EpCAM可通過(guò)激活cyclin A/E、c-myc基因等相關(guān)原癌基因的表達(dá)，從而起到致瘤作用[11]。EpCAM在鱗癌、乳腺癌等多種上皮性相關(guān)腫瘤組織中高表達(dá)，可作為上皮性腫瘤診斷和治療的一種候選蛋白。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、空載體組比較，si-HOTAIR組EpCAM mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，表明EpCAM表達(dá)降低可能通過(guò)抑制某些原癌基因表達(dá)起抑瘤作用。E-cadherin是一種鈣依賴性細(xì)胞黏附分子，通過(guò)同型細(xì)胞連接維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性，E-cadherin蛋白表達(dá)降低也是EMT的一個(gè)重要標(biāo)志[12]。Vimentin屬于中間絲蛋白，具有維持細(xì)胞與細(xì)胞器的形態(tài)、信號(hào)傳導(dǎo)、移植免疫及細(xì)胞調(diào)亡等多種生物學(xué)功能[13]。Vimentin表達(dá)異常能夠使細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)成明顯改變，上皮細(xì)胞的形態(tài)從立方形發(fā)展為紡錘形的纖維樣細(xì)胞，因此會(huì)易于遷移和游走。α-SMA能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。有研究表明，α-SMA表達(dá)可促使EMT改變，而EMT可參與生長(zhǎng)發(fā)育、損傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、空載體組比較，si-HOTAIR組Vimentin、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯下降，E-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明HOTAIR可通過(guò)影響E-cadherin、Vimentin和α-SMA表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控膀胱癌的生物學(xué)特征。趨化因子CXC家族有5種受體，CXCR1和CXCR2均為趨化因子受體，其在乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等細(xì)胞中均過(guò)表達(dá)，抗體封閉CXCR1和CXCR2則可抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、空載體組比較，si-HOTAIR組CXCR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，說(shuō)明HOTAIR可通過(guò)下調(diào)CXCR2表達(dá)，進(jìn)一步影響腫瘤生長(zhǎng)。MMPs是一類鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。MMP-2是MMPs比較重要的一個(gè)亞型，在乳腺癌、卵巢癌及鼻咽癌等組織中高表達(dá)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、空載體組比較，si-HOTAIR組MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，說(shuō)明HOTAIR可能通過(guò)影響MMP-2的表達(dá)，參與膀胱癌的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，沉默LncRNA HOTAIR表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制Notch1、EpCAM、CXCR2、Vimentin、MMP-2和α-SMA表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)有關(guān)。