生脈散對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞NF-κB/IκB及VEGF表達(dá)的影響

吳小慧，劉菲，段忠心

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽(yáng)421001)

2型糖尿病(T2DM)發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)因素是胰島素抵抗[1]，而胰島素抵抗還是一個(gè)慢性亞臨床炎癥反應(yīng)過(guò)程[2]。NF-κB/IκB信號(hào)通路是炎癥導(dǎo)致胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能減退以及動(dòng)脈粥樣硬化的重要途徑之一[3]。中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病的發(fā)病機(jī)制主要為陰津虧損、燥熱偏盛。生脈散是益氣養(yǎng)陰的基礎(chǔ)方，臨床常用于治療糖尿病，但目前對(duì)其作用機(jī)制尚不清楚。2015年3～12月,本研究觀察了生脈散對(duì)T2DM大鼠胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞NF-κB/IκB表達(dá)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響，旨在探討生脈散治療T2DM的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠120只，清潔級(jí)，8周齡，體質(zhì)量180～225 g，購(gòu)自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(湘)2015-0001。本研究經(jīng)南華大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 生脈散組方：人參9 g、麥門冬9 g、五味子6 g，購(gòu)自湖南三湘中藥飲片有限公司，經(jīng)加工研制成湯劑，由南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥房提供；SYBRGreen qPCR試劑盒(上海達(dá)為科生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)，阿司匹林腸溶片(湖南新匯制藥股份有限公司)；PCR儀器(美國(guó)ABI公司)，離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，血糖儀(長(zhǎng)沙三諾生物傳感股份有限公司)。

1.3 動(dòng)物分組、模型制備及藥物干預(yù) 將120只SD大鼠隨機(jī)分為A組20只和造模組100只。A組予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。造模組基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予高脂飼料(碳水化合物熱卡占20%，脂肪熱卡占61%，蛋白質(zhì)熱卡占19%，脂肪成分主要為熟豬油)喂養(yǎng)8周，一次性腹腔注射0.25%鏈脲佐菌素30 mg/kg(用pH 4.4的0.1 mol/L無(wú)菌枸櫞酸緩沖液配制)。注射72 h測(cè)血糖>16.7 mmol/L，表明造模成功。造模組建模成功70只，隨機(jī)分為B、C、D、E、F組，每組14只。B組給予等量生理鹽水灌胃，C組給予0.2 g/(kg·d)阿司匹林灌胃，D、E、F組給予4.7、9.4、18.8 g/(kg·d)生脈散湯劑灌胃，持續(xù)治療4周。實(shí)驗(yàn)期間，A、B、C、D、E、F組分別死亡6、3、1、2、1、3只。

1.4 空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)檢測(cè)及胰島素敏感性指數(shù)(ISI)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)計(jì)算 治療前及治療4周，大鼠進(jìn)食12 h，尾靜脈取血約5 mL，離心留取血清，-20 ℃冰箱保存。分別采用血糖儀和ELISA法檢測(cè)FPG、FINS，計(jì)算ISI、HOMA-IR。ISI=1/FBG×FINS，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.5 血清VEGF檢測(cè) 大鼠麻醉后球后取血5 mL，按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行加樣，封膜板蓋住反應(yīng)板，恒溫箱溫育約60 min，洗滌后加入顯色劑，恒溫避光顯色12 min，加入終止液，10 min后采用酶標(biāo)儀依序測(cè)量各孔的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計(jì)算血清VEGF水平。

1.6 主動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)觀察 大鼠麻醉后，迅速取出主動(dòng)脈組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)冠狀切片。切片分別予二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木素-伊紅染色、乙醇復(fù)脫、二甲苯透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.7 胰腺組織NF-κB、IκB mRNA檢測(cè) 大鼠麻醉后，迅速取出胰腺組織，- 80 ℃保存，按照試劑盒和逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取和cDNA制備，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。NF-κB上游引物：5′-AGTTGGAGCAGCTGCAGCGC-3′，下游引物：5′-GGAGGGCTCCGCTGGTT-3′；IκB上游引物：5′-GCAACCCAGTGGTGGCCCAG-3′，下游引物：5′-CTCCCGCTGGCTGACCTGGA-3′；β-action上游引物：5′-AGAACATCATCCCTGCATCC-3′，下游引物：5′-TGGATACATTGGGGGTAGGA-3′。經(jīng)吸光度掃描儀掃描，PCR條帶用軟件進(jìn)行定量分析，基因表達(dá)量用β-action內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果

2.1 各組治療前后FPG、FINS比較 見(jiàn)表1。

表1 各組治療前后FPG、FINS比較

注：與同組治療前比較，aP<0.05；與B組治療同期比較，bP<0.05；與C組治療同期比較，cP<0.05。

2.2 各組治療前后ISI、HOMA-IR比較 見(jiàn)表2。

2.3 各組治療前后血清VEGF水平比較 A、B、C、

表2 各組治療前后ISI、HOMA-IR比較

注：與同組治療前比較，aP<0.05；與B組治療同期比較，bP<0.05；與C組治療同期比較，cP<0.05。

D、E、F組血清VEGF水平分別為(211.430±11.359)、(273.910±4.527)、(258.690±4.423)、(262.170±5.149)、(247.080±4.907)、(245.450±3.532)pg/mL。與A組比較，B、C、D、E、F組血清VEGF水平均明顯升高(P均<0.05)；與B組比較，C、D、F組血清VEGF水平均明顯降低(P均<0.05)；與C組比較，E、F組血清VEGF水平均明顯降低(P均<0.05)。

2.4 各組主動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)比較 A組血管內(nèi)側(cè)壁平整光滑，平滑肌細(xì)胞排列整齊；與A組比較，B組血管內(nèi)側(cè)壁內(nèi)膜粗糙，平滑肌細(xì)胞排列紊亂；與B組比較，C、D、E、F組血管內(nèi)側(cè)壁內(nèi)膜稍粗糙，平滑肌細(xì)胞排列不規(guī)則，E、F組血管壁結(jié)構(gòu)損傷較C、D組有所緩解。

2.5 各組胰島β細(xì)胞NF-κB、IκB mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表3。

表3 各組胰島β細(xì)胞NF-κB、IκB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與B組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)糖尿病患者數(shù)量超過(guò)1億，其中T2DM約占90%[4]。在T2DM患者中，胰島素抵抗的發(fā)生率超過(guò)80%[5]，胰島素抵抗與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密切。糖尿病狀態(tài)下，高血糖、高血脂及胰島素抵抗等病理機(jī)制誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致糖尿病冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病發(fā)生、發(fā)展的重要原因[6]，通過(guò)降低炎癥反應(yīng)、改善胰島素抵抗、控制血糖水平是防治糖尿病性冠心病的重要途徑。

糖尿病在中醫(yī)學(xué)中屬于“消渴”范疇，主要病機(jī)為陰虛為本、燥熱為標(biāo)。生脈散出自《醫(yī)學(xué)啟源》一書，方中人參甘溫，有益元?dú)猓哂猩蛞骸⒀a(bǔ)肺氣的作用，用以為君；麥門冬甘寒，具有潤(rùn)肺生津、養(yǎng)陰清熱的作用，是為臣藥；人參與麥門冬合用，更彰顯益氣養(yǎng)陰之效；五味子酸溫，有斂肺止汗、生津止渴之功，為佐藥；三藥合用，一補(bǔ)一潤(rùn)一斂， 益氣養(yǎng)陰，氣充脈復(fù)，為益氣養(yǎng)陰的基礎(chǔ)方，臨床上常用于治療糖尿病[7,8]。但目前對(duì)其作用機(jī)制尚不清楚。

NF-κB是一個(gè)具有多向轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)節(jié)因子，是炎癥介導(dǎo)胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能減退的重要途徑，屬于炎癥反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要通過(guò)氧化應(yīng)激引起炎癥反應(yīng)，繼而導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[3]。IκB位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，主要在非激活狀態(tài)下通過(guò)攔截NF-κB的核定位序列阻止NF-κB的核定位，抑制其激活，IκB受IκK的調(diào)節(jié)，使其絲氨酸殘基磷酸化[9]，誘導(dǎo)IκB快速分解，充分暴露NF-κB的核定位序列，激活后迅速移位，與κB的位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞分化，引起胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能減退。同時(shí)，NF-κB還能誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞，使單核細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)膜遷移形成泡沫細(xì)胞，加速動(dòng)脈粥樣硬化，引起糖尿病相關(guān)并發(fā)癥[10]。VEGF能夠增加血管通透性，對(duì)單核細(xì)胞和巨細(xì)胞有化學(xué)趨化作用，是糖尿病血管病變的高危因子[11,12]，可引起血管壁結(jié)構(gòu)改變，加速動(dòng)脈粥樣硬化形成。

本研究結(jié)果顯示，E、F組能顯著降低FBS、FINS和HOMA-IR，升高ISI，降低血清VEGF水平，改善血管壁結(jié)構(gòu)，降低NF-κB mRNA，提高IκB mRNA表達(dá)，效果優(yōu)于C組；而D組上述效果與C組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明精確的劑量控制才能使生脈散發(fā)揮最佳的治療效果。

總之，生脈散能夠明顯改善T2DM大鼠胰島素抵抗，降低血清VEGF水平，改善血管壁結(jié)構(gòu)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB/IκB表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。