從一到一萬：基因編輯在遺傳疾病治療中的應用

■文 /常 興

隨著單堿基基因編輯工具的進一步完善，它將在人類的遺傳性疾病的基因治療中發揮越來越多的作用。

生命的遺傳物質是DNA?；蚝帽仁且淮蒁NA堿基“字母”拼起來的詞句，構成了生命的“遺傳天書”。如果“字母”出錯，基因就不能正常行使功能，甚至產生有害的功能，引起各種各樣的疾病。而“遺傳天書”中的錯誤，既有單個字母的“錯字”，也有成千上萬個“字母”的缺失。自從人類基因組計劃完成以來，人類第一次完全破譯了DNA的“遺傳天書”，疾病的遺傳學基礎一一被闡明，如何修復這些疾病相關的“錯誤”，是科學家面臨的新的挑戰。

近年來基因編輯技術的發展，首次使DNA可以直接成為藥物開發的靶標，修復“遺傳天書”中的錯誤，從而根治一些疾病，尤其是單基因遺傳性疾病。現在最常用的CRISPR/Cas9基因編輯技術，好比是一把可以精確控制的“剪刀”，將“剪刀”精確定位到某些區域內的基因上，同時提供正確的修復模板，用以實現突變基因的修復。然而，“剪刀”也會造成目的基因的破壞和刪除，無法同時實現精確和高效修復的目的。為開發更好的基因編輯方法，近年來，科學家逐步把單一功能的CRISPR “剪刀”, 改造成多功能的“瑞士軍刀”。例如，單堿基基因編輯技術，利用CRISPR的精準定位功能，招募特定的堿基修飾酶，就可以直接對單個“字母”進行修改，完成單堿基的基因編輯，治療單個“字母”錯誤造成的疾病。此外，研究還發現，精確地針對某些“字母”進行置換，也可以修復上萬個“字母”缺失造成的疾病。因此，這一技術有可能在人類疾病治療中得到廣泛的應用。

CRISPR/Cas9基因編輯技術

CRISPR/Cas系統是細菌中的適應性免疫系統,原本是細菌用于降解噬菌體DNA的機制。經過遺傳工程改造的CRISPR/Cas9系統僅包括1個Cas9 蛋白和1條向導RNA（sgRNA）,在sgRNA的定位下, Cas9蛋白可以像剪刀一樣, 對靶向DNA進行切割。利用CRISPR/Cas進行基因編輯，只需提供20 個堿基對的特異性核酸序列，因此，其構建過程相對之前的基因操作技術更加簡單、快捷，適合規?；⒏咄康慕M裝，操作簡單，制作成本低，受到越來越廣泛的應用。盡管具有很多優勢，但常用的CRISPR/Cas系統也存在一些缺點。

首先，利用CRISPR/Cas9技術進行修復突變的效率較低。CRISPR/Cas9主要采用同源重組的方式，同源重組主要發生在細胞分裂的DNA復制前期和復制期，因此在不分裂的體細胞中，同源重組基本上無法實現。此外，基于CRISPR的基因編輯依賴于對DNA雙鏈的切割，而DNA斷裂造成的損傷可能造成哺乳動物細胞癌變；在一些細胞中，DNA斷裂可造成細胞死亡，使依賴于CRISPR酶切活性的基因編輯無法實現。

其次，CRISPR/Cas9不僅靶向編輯目標DNA位點，而且會切割那些與靶位點序列相同(或高度相似)的其他DNA位點，使其產生突變，即脫靶效應。脫靶效應是CRISPR/Cas9基因編輯技術所面臨的最主要問題。由于Cas9蛋白對sgRNA序列與靶位點間的錯配不完全敏感，其脫靶風險較高。

基于以上原因，現在的CRISPR/Cas9技術應用大多針對細胞系或體外培養的干細胞，或者對模式生物進行基因編輯，對于大部分的體細胞只能進行基因敲除，無法精確地進行基因修復?，F階段利用CRISPR基因編輯技術開展疾病治療，也主要是利用非同源末端連接的修復模式。

很多人類疾病，都是單堿基突變造成，因此通過單堿基基因編輯，修復錯誤的堿基，可以直接應用于這些疾病的基因治療。

基于靶向性胞嘧啶脫氨酶的單堿基基因編輯技術

在哺乳動物細胞內，大部分細胞的同源重組效率很低，這決定了現在的CRISPR技術只能進行有效的“刪除”，無法對DNA序列進行高效的“替換”。但是，在免疫系統中有一個高效的DNA突變體系，也就是抗體蛋白的親和力成熟過程。免疫球蛋白進行高頻突變，對編碼的DNA序列進行隨機“替換”，獲得高親和力的抗體。研究發現，這一過程主要由一個胞嘧啶脫氨酶（AID）介導。通過高頻突變，抗體分子的氨基酸序列發生隨機改變，經過正向選擇使含有高親和力抗體的B細胞選擇性擴增，對此過程進行迭代，最終演化出高親和力的抗體。

基于AID可以進行高效的誘導突變，將DNA序列進行“替換”，提示我們可以將這一特點和CRISPR相結合。我們發現，將dCas9和AID融合，可以利用dCas9的靶向功能，把AID蛋白招募至細胞內源的DNA上，在任何感興趣的位點誘導高頻突變。我們證明dCas9-AID融合蛋白（TAM）具有多個獨特的功能，包括：（1）胞嘧啶可以隨機地向其他3個堿基轉變；（2）dCas9-AID融合蛋白的活性只依賴于sgRNA，與AID識別的一級序列無關；（3）dCas9-AID可以同時誘導多個胞嘧啶的突變，并且這一方法不依賴于DNA切割和修復，可以大幅提高單堿基精確編輯的效率，避免了DNA的雙鏈斷裂；（4）在一種多肽抑制劑 (uracil glycosylase inhibitor，UGI)存在的情況下，TAM可以誘導胞嘧啶(C)向胸腺嘧啶(T)轉變，并且其活性只局限于前間隔序列（protospacer）內的特定堿基; （5）利用dCas9-AID可以有效地預測出小分子抑制劑的耐藥性突變。作為遺傳操作的新技術，靶向性胞嘧啶脫氨酶有著廣泛的應用前景，可以為分子進化、基因治療和在單堿基水平上分析基因調控元件等領域提供新的方法。

除了最初的胞嘧啶單堿基編輯之外，美國哈佛大學的科學家還通過蛋白人工進化，開發出了針對腺嘌呤的單堿基編輯，可以將A轉化為G；麻省理工學院的科學家將靶向RNA的CRISPR蛋白Cas13a和腺嘌呤脫氨酶ADAR融合，用于在RNA上誘導A到G的突變。很多人類疾病，都是單堿基突變造成，因此通過單堿基基因編輯，修復錯誤的堿基，可以直接應用于這些疾病的基因治療。但是，現在的單堿基編輯平臺仍然不夠準確，往往會在臨近的2～3個堿基同時造成突變，有可能會引起其他意想不到的后果。因此，對靶點的選擇和治療方案的設計，都需要認真的考量。另外，即使同一種遺傳疾病，不同患者往往有不同的致病突變，有可能需要對每個患者開發特異的治療方案，全面衡量其效率，這從經濟上和成本上都面臨巨大的挑戰。

利用單堿基基因編輯技術修復RNA剪接缺陷

在真核細胞中，基因在轉錄后還受多種不同機制的調節，包括可變剪切、差異化3’聚腺苷酸化、微小RNA介導的基因沉默等。據估計，超過75%的人類基因具有一種以上的信使RNA（mRNA）剪接方式，其中大部分可以翻譯為功能性蛋白質，與RNA表達的組織特異性一起，共同造成轉錄組的組織特異性，介導細胞的分化，賦予不同細胞截然不同的功能，是決定細胞命運的重要環節。因為RNA剪接的重要作用，mRNA剪接的異常是許多疾病的直接誘因，估計35%～50%的人類疾病是由基因剪接異常造成。

針對RNA剪接過程進行修復是很多遺傳疾病的治療靶點。現有的調控RNA剪接的方法是通過反義寡聚核苷酸（ASO）。ASO經過特殊修飾，通過互補配對結合到RNA上后，不誘導RNA的降解，而阻斷相應蛋白和RNA的相互作用，調控RNA的剪接。但是，因為RNA二級結構的影響，往往需要對ASO進行大量篩選，才能獲得有效的調控特定RNA剪接的ASO序列。

利用ASO調控RNA剪接，針對一些遺傳疾病，最近獲得了一些成功：在臨床試驗中，對杜氏肌肉萎縮癥 (DMD)和脊髓性肌萎縮癥 (SMA)都有一定的緩解作用。然而，ASO療法也面臨一些內在的挑戰，例如，大部分ASO只能有效地靶向到肝臟，無法通過血腦屏障，修復神經細胞；因為ASO作用到RNA，其作用是瞬時的，需要持續給藥；ASO的合成需要復雜的修飾，因此臨床應用價格昂貴（約20萬美元/年）；更重要的是，一些ASO療法的效果十分有限, 例如針對杜氏肌肉萎縮癥的ASO只能恢復約1%的肌萎縮蛋白表達。因此，無論從科學研究還是臨床應用角度，都亟須開發出新的調控RNA剪接的基因編輯方法。

絕大多數基因中內含子的剪接位點由GU-AG構成，我們發現并證明可以利用之前開發的單堿基基因編輯，將內含子剪接位點的鳥嘌呤(G)突變成腺嘌呤(A)，使這一剪接位點不能被剪接體識別，從而特異性阻斷外顯子識別，調控內源性mRNA的剪接。通過這一策略，有望針對多種RNA剪接缺陷造成的疾病起到治療作用。

例如，杜氏肌營養不良癥是一種致命的遺傳疾病，每4000名男性中就有一人患有此遺傳疾病。DMD的發病機理很簡單，由于遺傳突變破壞了DMD基因讀碼框，或產生提前終止密碼子，造成肌萎縮蛋白的完全缺失，引發肌肉萎縮和癱瘓，最終造成心臟或肺功能的衰竭。過去研究證明，如果通過外顯子跳躍，恢復蛋白讀碼框以產生內部截短的Dystrophin蛋白，可以用來治療DMD。在我們前期的研究中，建立了DMD患者來源的誘導型多能干細胞。這個患者因為DNA大片段的缺失，超過1萬個堿基的缺失，造成了DMD基因的移碼突變和肌萎縮蛋白的完全缺失。我們通過設計基因編輯策略，在剪接位點精確地誘導了鳥嘌呤到腺嘌呤的突變，造成相應外顯子的跳讀，恢復了mRNA的讀碼框和肌萎縮蛋白的表達。進一步在體外分化的心肌細胞中證明心肌細胞的缺陷被完全修復。更重要的是，通過全基因組測序，只發現了一個脫靶位點，其位于基因間區域，對周圍的基因編碼和表達都沒有影響。除此之外，我們還證明類似的策略可以用于多種RNA剪接疾病的治療。

單堿基基因編輯的應用，現在還處于起始階段，隨著對這一工具的進一步完善，它將在人類的遺傳性疾病的基因治療當中發揮越來越多的作用。