4-硝基苯胺降解菌的篩選及其代謝物研究

華益?zhèn)? 彭世文 凌敏

摘要? ? 為解決4-硝基苯胺（4-NA）難以降解的難題，本研究采用梯度馴化法分離篩選到一種對4-硝基苯胺具有較高耐受能力的細菌HY18，其10 mL LB發(fā)酵液48 h對100 mL濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺溶液的去除率可達69.88%。通過形態(tài)觀察和16S rDNA測序試驗，細菌HY18被鑒定為蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）。選取大腸桿菌作為指示微生物以及綠豆作為指示植物，對中間產(chǎn)物進行毒性分析。結(jié)果表明，該生物降解過程低毒無害，與環(huán)境相容性好。本研究篩選的降解菌HY18可以為4-硝基苯胺污染修復(fù)提供有效解決方案。

關(guān)鍵詞? ? 4-硝基苯胺;生物降解;中間產(chǎn)物;代謝途徑;毒性分析

中圖分類號? ? X53? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼? ? A? ? ? ? 文章編號? ?1007-5739（2018）23-0181-03

硝基苯類物質(zhì)在農(nóng)藥、炸藥、染料、聚合物及香料等化工生產(chǎn)中廣泛使用，使該類物質(zhì)在環(huán)境中不斷積累，污染危害嚴(yán)重。我國把苯胺類化合物列入環(huán)境中的重點污染物，最高容許排放濃度為5 mg/L[1]。硝基苯類物質(zhì)中4-硝基苯胺（4-NA）是一種重要的化工原料，其使用量大，也是常見的工業(yè)排放物，被國家環(huán)境保護總局規(guī)定為優(yōu)先控制污染物[2]。4-硝基苯胺可通過呼吸和消化途徑進入人體，促使氧與血紅蛋白結(jié)合變?yōu)楦哞F血紅蛋白，影響供氧而造成窒息，且對人體有很強的致癌性[3]。4-硝基苯胺毒性大、降解處理困難，國內(nèi)研究較少，至今絕大多數(shù)采用物理、化學(xué)法進行處理，但這些方法費用偏高，且操作要求較為嚴(yán)格，因而在生物降解方面研究較少[4-9]。因此，研究4-硝基苯胺的生物降解，對保護環(huán)境和人類健康具有重要意義。本研究從4-硝基苯胺污染的土壤中篩選到具有對4-硝基苯胺生物降解能力的功能微生物蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）菌株HY18，并對降解產(chǎn)物進行了毒性檢驗分析、鑒定并推測4-硝基苯胺的生物降解路徑。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試土樣

土壤樣品采自長期受4-硝基苯胺污染的土地。用滅菌土鉆鉆取水稻田5～20 cm土壤2 kg，混勻后分裝于無菌密封袋，放于冰盒中帶回實驗室于4 ℃保存。

1.2? ? 培養(yǎng)基配方

1.2.1? ? 富集培養(yǎng)基。4-硝基苯胺5 mg/L，葡萄糖15 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 4.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2.2? ? LB培養(yǎng)基。蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2.3? ? 篩選培養(yǎng)基。4-硝基苯胺5 mg/L，葡萄糖15 g/L，NaCl 5 g/L，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g/L，pH值7.0～7.2。

1.3? ? 試驗方法

1.3.1? ? 4-硝基苯胺降解菌的篩選與鑒定。采用搖瓶富集培養(yǎng)：取土壤樣品各10 g溶于100 mL無菌去離子水中，磁力攪拌30 min制備土壤懸浮液。取土壤懸浮液1 mL接種于100 mL濃度為5 mg/L的4-硝基苯胺的富集培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱中在37 ℃、150 r/min條件下富集培養(yǎng)3 d。取1 mL細菌富集液進行10倍梯度稀釋，取100 μL稀釋液涂布于4-硝基苯胺濃度為5 mg/L的篩選平板培養(yǎng)基上;于37 ℃培養(yǎng)3 d后，將生長良好的菌落繼續(xù)依次轉(zhuǎn)接至濃度為10、20、40 mg/L的篩選平板培養(yǎng)基上;于37 ℃培養(yǎng)3 d后，選取在濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺篩選平板培養(yǎng)基上生長情況最好的細菌為4-硝基苯胺耐受菌。將篩選到的菌株轉(zhuǎn)接于LB平板上，進行劃線分離純化，接種于LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵，用40%甘油于-70 ℃保存。

4-硝基苯胺的含量采用高效液相色譜來檢測，測定方法參照文獻[10-12]，并進行了改進。檢測條件：高效液相色譜儀為Agilent 1260;檢測器為2498紫外/可見光檢測器，檢測波長為265 nm;色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）;流動相為甲醇∶水=60∶40（體積比），流速為0.8 mL/min;進樣量為10 μL;柱溫為37 ℃。

無菌條件下，挑取4 ℃保存于斜面上的4-硝基苯胺耐受菌菌株，接種于無菌LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)8～10 h制成種子液;將種子液按2%的比例接種于不含4-硝基苯胺的富集培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)48 h，得到耐受菌發(fā)酵液。配制濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺溶液，將10 mL耐受菌發(fā)酵液接種至100 mL 4-硝基苯胺溶液中，在恒溫搖床中以120 r/min振蕩培養(yǎng)，3 d后將搖瓶中溶液定容至100 mL測定耐受菌對4-硝基苯胺的降解率。選擇降解能力最大的耐受菌為最終降解菌，并進行菌種鑒定[13]。

配制濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺溶液，將10 mL降解菌發(fā)酵液接種至100 mL 4-硝基苯胺溶液中，在恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速120 r/min），測定隨時間變化4-硝基苯胺濃度的變化，繪制降解曲線，測定時間分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0 h。

16S rDNA基因序列分析：以提取菌株的基因組為模板，用細菌16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增，參照天根生化科技有限公司的DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收，純化后的產(chǎn)物測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司的ABI 3730XL自動測序儀完成。所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行Blast比對分析，利用Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定菌株的種屬[13]。

1.3.2? ? 降解物的毒性分析。測定4-硝基苯胺及其代謝物的毒性，測定其抑制效果[14-16]。選取大腸桿菌（Escherichia coli）作為指示微生物，測定4-硝基苯胺及其代謝物的毒性。將大腸桿菌接種至LB培養(yǎng)基中，于30 ℃搖床培養(yǎng)24 h。取25 mL發(fā)酵液分別加入25 mL濃度為50、100 mg/L的4-硝基苯胺或其代謝物，使4-硝基苯胺或其代謝物的最終濃度分別為25、50 mg/L。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，對照組加蒸餾水。24 h后通過梯度稀釋平板計數(shù)法測定大腸桿菌活細胞數(shù)，通過與對照組對比計算大腸桿菌抑制率。

選取綠豆作為指示植物，測定4-硝基苯胺及其代謝物的毒性。在濕潤的定性濾紙上種植20粒種子，待種子發(fā)芽露白后分別滴加10 mL濃度為25、50 mg/L的4-硝基苯胺或其代謝物。每個處理設(shè)置3次重復(fù)，對照組加蒸餾水，放置于人工氣候箱培養(yǎng)4 d，觀察不同組分對綠豆幼苗的生長狀況，測定記錄其苗長，計算平均值。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 4-硝基苯胺降解菌的篩選

從4-硝基苯胺污染的土壤中取樣，通過搖瓶富集培養(yǎng)、不同4-硝基苯胺濃度篩選培養(yǎng)基梯度篩選的方法獲得4-硝基苯胺耐受菌。測定耐受菌是否對4-硝基苯胺有降解能力，選擇降解率最大的耐受菌為降解菌。

采取4-硝基苯胺濃度梯度馴化法，初篩結(jié)果如表1所示，從濃度為5 mg/L的4-硝基苯胺的LB平板上篩選到不同的菌落共計22個。繼續(xù)轉(zhuǎn)接至10、20 mg/L等濃度的LB平板上，其中大部分菌落耐性逐漸減弱，剩下7個仍表現(xiàn)出較好的生長情況。直至轉(zhuǎn)接于40 mg/L培養(yǎng)基，僅剩下3個菌落仍具有較強4-硝基苯胺耐受性。從中選出生長情況較好的菌株HY8、HY16、HY18作為進一步研究的供試菌種，測定其對4-硝基苯胺的降解率。

配制濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺溶液，10 mL耐受菌HY8、HY16、HY18發(fā)酵液接種至100 mL 4-硝基苯胺溶液中，在恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速120 r/min）。3 d后將搖瓶中溶液定容至100 mL，測定耐受菌對4-硝基苯胺降解率，結(jié)果如圖1所示。耐受菌HY8、HY16、HY18降解3 d后對4-硝基苯胺降解率分別為43.57%、35.8%、68.62%，選擇降解能力最強的耐受菌HY18為最終降解菌。

通過接種降解菌HY18，4-硝基苯胺被降解為次生代謝物，此生物降解過程釋放的能量被轉(zhuǎn)化為ATP供蒼白桿菌HY18存活和生長繁殖;4-硝基苯胺的一部分C和N元素被HY18吸收用于組成其細胞各種結(jié)構(gòu)。剛接種時，4-NA溶液中降解菌菌數(shù)最大，但由于細菌對環(huán)境需要一個適應(yīng)過程，故在0～2 h內(nèi)，細菌對4-NA降解率較低，2 h降解率為3.9%;此后，細菌HY18降解4-硝基苯胺速率加快，8 h降解率達21.1%，24 h時降解率達61.06%;此后，由于營養(yǎng)匱乏，細菌細胞逐漸死亡，降解速度下降，36 h降解率為65.49%;48 h對4-NA的降解率達到最高值，為69.88%（圖2）。

通過接種HY18，4-硝基苯胺能夠很好地被降解。由于降解試驗設(shè)置4-硝基苯胺濃度為40 mg/L，用10 mL降解菌發(fā)酵液降解100 mL不含其他營養(yǎng)物質(zhì)的4-硝基苯胺溶液，則4-硝基苯胺48 h降解率仍然達69.88%。由此可見，HY18對4-硝基苯胺具有比較好的生物降解效果，是一種應(yīng)用前景較好的微生物。若在4-硝基苯胺溶液中添加如葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)，降解菌HY18可以繼續(xù)生長，其對4-硝基苯胺的降解率將會更高。

2.2? ? 4-硝基苯胺降解菌的鑒定

HY18接種在LB平板培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)3 d后，菌落濕潤帶淺黃色，邊緣整齊光滑且顏色較中間稍淺，有光澤，中間稍稍隆起，革蘭氏染色試驗結(jié)果為陰性。在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該細菌無芽孢形成，呈細桿狀。

將菌株HY18的16S rDNA基因序列與GenBank的核酸序列進行同源性比對（Blast），菌株HY18同Ochrobactrum sp.（KF987808）的相似度達到99%。使用軟件Mega 4.0以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，并結(jié)合各菌株菌落形態(tài)特征，菌株HY18被鑒定為蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）。

2.3? ? 降解產(chǎn)物毒性分析

由圖4可以看出，4-硝基苯胺對大腸桿菌和綠豆2種指示生物都有較強的抑制作用，而4-硝基苯胺代謝物對大腸桿菌和綠豆的毒性較低。

大腸桿菌接種至4-硝基苯胺溶液中細胞死亡數(shù)較高，25、50 mg/L的4-硝基苯胺對大腸桿菌的抑制率分別高達81.4%、87.4%。而4-硝基苯胺代謝物對大腸桿菌抑制率較低，分別為19.2%、32.7%。

在蒸餾水對照組的影響下，對照組綠豆苗長的平均值為5.4 cm;滴加25、50 mg/L的4-硝基苯胺后，綠豆生長受到抑制，苗長分別2.3、1.9 cm;滴加25、50 mg/L的4-硝基苯胺代謝物對綠豆生長抑制作用則比較弱，苗長分別達4.7、3.6 cm。

由上述結(jié)果可知，4-硝基苯胺對大腸桿菌及綠豆有巨大的毒害作用，通過蒼白桿菌HY18的降解后，大部分4-硝基苯胺被利用，其代謝物對2種指示生物的抑制作用較低。試驗結(jié)果表明，通過篩選出的降解菌對4-硝基苯胺進行降解，含有4-硝基苯胺的溶液生物毒性明顯降低。

3? ? 結(jié)論與討論

本研究篩選獲得了能夠?qū)?-硝基苯胺進行生物降解的功能菌蒼白桿菌HY18（Ochrobactrum sp.），此前蒼白桿菌僅在間苯氧基苯甲醛降解上有報道，未見對4-硝基苯胺有生物降解能力方面的報道;研究了HY18的生長降解曲線，證實了其對4-硝基苯胺具有比較好的生物降解效果，其LB培養(yǎng)基發(fā)酵液對4-硝基苯胺的去除率可達69.88%;毒性分析試驗結(jié)果顯示，4-硝基苯胺降解代謝物低毒無害。以上結(jié)果表明，降解菌HY18具有解決土壤中4-硝基苯胺污染問題的巨大潛能。

4? ? 參考文獻

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