兩種高效液相色譜法測定雙黃連注射液中連翹苷含量的比較研究*

章榮葉，羅成江，湯賽飛，王彬，陳曉林，林仙軍

（1.臺州市屠宰管理所 浙江臺州318000；2.浙江省獸藥飼料監察所 杭州 311101；3.浙江建安檢測研究院有限公司 杭州 310006）

雙黃連注射液由金銀花、黃芩和連翹三味中藥材制成，主要含有綠原酸、黃芩苷和連翹苷等有效成分[1]。獸醫臨床用于預防和治療畜禽外感風寒所致的上呼吸道感染[2]、急性支氣管炎[3]、急性扁桃腺炎[4]和輕型肺炎等[5]。目前，該質量標準收載于《獸藥質量標準》2017年版（中藥卷）[6]。標準采用薄層色譜法鑒別綠原酸、黃芩苷和連翹，采用HPLC法測定黃芩苷的含量，未對連翹苷進行質量控制。目前，連翹苷含量測定的高效液相色譜方法主要有熒光檢測法[7]和紫外法[8-11]。因此，本文對連翹苷檢測的兩種方法進行了比較研究，然后利用建立的方法進行實際樣品檢測，為完善雙黃連注射液的質量控制積累數據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

連翹苷對照品購于中國食品藥品檢定研究院，批號110821-201213，含量95.3%；雙黃連注射液，規格為10mL，批號為 20180801、20180802、20180803等3批。乙腈、甲醇均為色譜純，德國默克公司；磷酸、三乙胺和磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水。

Agilent 1260高效液相色譜儀，配VWD檢測器（美國Agilent公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Waters 2695-2475高效液相色譜儀（配Empower 2軟件）；梅特勒-托利多METTLER TOLEDO XS-205電子天平（精度為0.01mg）。

1.2 高效液相色譜-熒光法

1.2.1 對照品溶液和供試品溶液的配制 取連翹苷對照品適量，加50%甲醇溶液配制成每1mL中含連翹苷約1μg/mL的溶液，為連翹苷對照品溶液；取雙黃連注射液1.00mL，于50mL量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋，定容；再取該溶液5.00mL，于50mL量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋，定容，過0.45μm有機濾膜，上機測定。

1.2.2 液相色譜參考條件 色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5.0μm）；熒光檢測條件為激發波長277nm，發射波長315nm；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進樣量為20μL；流動相：乙腈-水（25∶75，v∶v）。

1.3 高效液相色譜-紫外法

1.3.1 對照品溶液和供試品溶液的配制 取連翹苷對照品適量，加50%甲醇溶液配制成每1mL中含連翹苷約100μg/mL的溶液，為連翹苷對照品溶液；取雙黃連注射液1.00mL，于5mL量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋，定容，過0.45μm有機濾膜，上機測定。

圖1 對照品溶液（濃度為1μg/mL）色譜圖（熒光檢測器）

圖2 供試品溶液（批號為20180101）色譜圖（熒光檢測器）

圖3 對照品溶液（濃度為1 μg/mL）色譜圖(紫外檢測器）

1.3.2 液相色譜參考條件 色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5.0μm）；檢測波長278nm，柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進樣量為20μL；流動相：乙腈-水（25∶75，v∶v）。

2 結果與分析

2.1 熒光檢測條件的確定

熒光檢測條件的確定及掃描方法參考文獻[12]，首先將儀器的激發波長設定為200nm，發射波長掃描范圍為210~800nm，掃描后發現發射波長在277nm處有最大吸收；因此，將277nm的波長作為發射波長固定下來，做激發波長的掃描，掃描結果發現激發波長在315nm處有最大吸收。因此確定熒光檢測條件為激發波長277nm、發射波長315nm。

2.2 色譜柱的選擇

分別對Waters Symmetry C18、Waters Atlantis C18和Agilent ZORBAX Extend-C18等三種色譜柱進行檢測，結果這三種色譜柱都可以用于連翹苷的檢測。

2.3 流動相的選擇

比較了磷酸鹽緩沖液-乙腈、磷酸溶液-乙腈和水-乙腈體系，結果發現水-乙腈流動相體系連翹苷峰型最好、靈敏度最高。優化配比，使連翹苷獲得最佳保留時間，最終確定流動相為乙腈-水（25∶75，v∶v），流速為1.0mL/min。

2.4 線性考察、檢測限和定量限

取標準系列工作溶液進樣檢測，以峰面積Y對濃度X（μg/mL）作標準曲線。熒光檢測法得出回歸方程為Y＝6.72×105X-2.36×104， 相 關 系 數 R2為0.9999， 在 0.01~10.0μg/mL 的濃度范圍內呈良好的線性關系；紫外檢測法得出回歸方程為Y＝3.66×105X+1.06×104，相關系數R2為 0.9999， 在 1~200μg/mL 的濃度范圍內呈良好的線性關系。

表1 兩種方法測定雙黃連注射液中連翹苷含量結果比較（n=3）

圖4 供試品溶液（批號為20180101）色譜圖（紫外檢測器）

2.5 高效液相色譜結果分析

按照上述方法測定，典型色譜圖見圖1-4。

2.6 兩種方法結果比較

對高效液相色譜-熒光檢測法和高效液相色譜-紫外檢測法的結果進行比較，每批3次測定相對標準偏差均在3.0%以內，兩種方法含量測定平均值的相對偏差在3.0%以內，表明結果無顯著差異。

3 結論

試驗結果表明，熒光法和紫外法測定雙黃連注射液中連翹苷的含量，結果無顯著差異，兩種方法都可以用于連翹苷的測定，熒光檢測法響應較高，不易受雜質干擾，對于低含量、雜質較多的樣品，影響因素較少，抗干擾強；紫外法響應低，易受雜質干擾，誤差較大。■