CSFV的反向遺傳系統

趙妍

【摘 要】對于家豬和野豬來說，豬瘟是一種具有極高傳染力及高致死率的烈性傳染病。豬瘟是由豬瘟病毒（Classic Swine Fever Virus， CSFV）引起的病毒性傳染病，CSFV屬于黃病毒科，瘟病毒屬，是一種單股正義RNA病毒。在CSFV的研究當中，反向遺傳學應用十分廣泛，論文主要介紹幾種比較成熟的CSFV反向遺傳系統。近年來，反向遺傳學在CSFV的研究方面得到不斷發展，論文就CSFV的幾種反向遺傳系統進行系統闡述，以期為CSFV的研究及防控提供參考。

【關鍵詞】CSFV;豬瘟;反向遺傳學

【Keywords】CSFV; classical swine fever; reverse genetics

【中圖分類號】S852.65? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?【文獻標志碼】A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?【文章編號】1673-1069（2018）12-0182-02

1 引言

反向遺傳學是利用病毒的全長基因組來產生完整病毒的方法，是現在病毒學研究中最強有力的工具。反向遺傳學通常用于研究病毒復制、感染、蛋白功能、病毒與宿主的相互作用、抗病毒及疫苗研究[1]。近年來，反向遺傳學在CSFV的研究方面得到不斷發展，本文就CSFV的幾種反向遺傳系統進行系統闡述，以期為CSFV的研究及防控提供參考。據統計，我國每年因豬瘟造成的經濟損失已超過100億元。豬瘟嚴重阻礙養殖業的健康發展，并對食品安全造成威脅。因此，對該病進行全面、綜合防控，具有必要的現實意義。本文對CSFV及功能相關基因、蛋白的研究進展進行介紹，為全面了解CSFV、全方位防控豬瘟提供理論支持。

2 CSFV的幾種反向遺傳系統

2.1 T7 RNA聚合酶介導的體外轉錄反向遺傳學系統

T7 RNA聚合酶，是一種高度特異識別T7啟動子序列的DNA依賴的5'→3'RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase可以催化單鏈或雙鏈DNA T7啟動子下游NTP的摻入，合成與T7啟動子下游的模板DNA互補的RNA[2]。

Meyers（Meyers et al.， 1996）首先對CSFV 5到3進行了全基因組鑒定，將CSFV全基因組克隆到低拷貝質粒中，并在基因組3端加入T7啟動子，利用Srf I將質粒線性化后，在T7 RNA聚合酶作用下體外轉錄得到RNA，并轉染進SK6細胞系中拯救病毒，這一方法在現在的CSFV研究中依然應用十分廣泛。Fan（Fan et al.， 2009）將上述方法進行了改進，將由T7 RNA聚合酶體外轉錄產生的vRNA轉染到BHK21細胞系中，培養一段時間后，將含有病毒的上清感染PK15細胞，用此方法得到的CSFV病毒滴度是之前的8倍左右。

2.2 T7 RNA聚合酶介導的體內轉錄反向遺傳學系統

Gennip（Gennip et al.， 1999）建立了一種更方便、高效的體內轉錄反向遺傳系統。首先他建立了可以穩定表達T7 RNA聚合酶的SK6細胞系SK6-T7 RNA pol，將線性化的CSFV cDNA轉染該細胞系，轉錄過程在細胞中完成并得到病毒RNA，產生CSFV病毒，該方法大大提高了病毒滴度，其滴度約為體外轉錄的200倍[3]。Bergeron（Bergeron， 2002）通過在CSFV 3端插入了HDV核酶及T7終止子，構建了一種新型的基于T7 RNA聚合酶的體內轉錄反向遺傳學系統，該系統不需要Srf I就能在CSFV末端形成精確的3NCR，節約了構建成本。

2.3 II型RNA聚合酶介導的反向遺傳學系統

Li（Li et al.， 2013）在CSFV 5NCR加入CMV啟動子、T7啟動子和HamRZ，在3NCR加入HdvRZ，T7終止子和SV40 polyA，HamRZ與HdvRZ可以生成正確的5NCR及 3NCR，且能在T7 RNA聚合酶或者II型RNA聚合酶的作用下進行轉錄，該方法拯救的病毒滴度是體外轉錄的120倍。

2.4 I型RNA聚合酶介導的反向遺傳學系統

本實驗室在上述基礎上，構建了一種新的依賴pol Ⅰ拯救病毒的CSFV cDNA克隆，我們在PK15細胞基因組中擴增得到豬的啟動子，并參照文獻合成在哺乳動物細胞中具有極高終止效率的鼠終止子，分別插入CSFV 5NCR之前和3NCR之后。該系統能直接將質粒轉染到細胞中，拯救出CSFV病毒，這種基于pol Ⅰ啟動子的反向遺傳操作系統能產生具有精確末端基因組的CSFV，且具有更高的拯救效率，為后續修飾性減毒活疫苗和標記疫苗的研發奠定了堅實的基礎。

3 帶有標記的CSFV反向遺傳系統

基于傳統的反向遺傳系統，具有標記或定量功能的CSFV cDNA克隆被設計出來，如在Li實驗組建立了一種簡化的中和抗體試驗，用于檢測CSFV，首先在Npro后插入了EGFP基因，在病毒產生的同時合成EGFP，從而省去熒光染色，達到檢測病毒的目的[4]。本實驗室在1.4中的反向遺傳系統的基礎上，在Npro后面加入了Rluc基因，得到了可以用于定量實驗的CSFV反向遺傳系統，即可以通過收集Rluc氧化過程中釋放的生物熒光，定量地檢測轉錄因子與目的基因的相互作用。

帶有標記的CSFV反向遺傳系統在傳統的反向遺傳系統的基礎上，進一步簡化了實驗步驟，在達到實驗目的的同時，使反應更加快速，簡便，增加了方法的實用性，為后續開展修飾性減毒活疫苗和標記疫苗的研發做了很好的鋪墊。

4 展望

反向遺傳操作系統為RNA 病毒研究提供了一個強有力的平臺，能夠恢復具有全長病毒基因組的病毒[5]。利用這個平臺，人們可以通過基因重組、基因突變等 手段來研究病毒的復制、感染，病毒蛋白的功能、病毒與宿主細胞之間的關系。抗病毒策略和標記疫苗的發展也離不開反向遺傳操作，如找出與毒力相關性基因，對其進行缺失或修飾處理，從而得到新的無毒或減毒毒株，以此制備新型的減毒活疫苗，同時可以制備嵌合抗體，開發多價疫苗[6]。反向遺傳系統作為動物病毒的研究方法，已廣泛應用于動物疫苗、CSFV毒力機制及蛋白功能研究中，極大地推動了動物病毒的研究發展，為疾病的研究及防控起著重要作用。

【參考文獻】

【1】Bergeron， L.J. Development and comparison of procedures for the selection of delta ribozyme cleavage sites within the hepatitis B virus[J]. Nucleic Acids Research， 2002（30）： 4682-4691.

【2】Fan， Y.F.， Zhao， Q.Z.， Zhao， Y.， etc. Recovery of the Infectious Classical Swine Fever Virus from the Cloned cDNA of Low Temperature Attenuated Thiverval Strain[J]. Chinese Journal of Animal & Veterinary Sciences，2009（40）， 1420-1425.

【3】Gennip， H.G.P.v.， Rijn， P.A.v.， Widjojoatmodjo， M.N.， etc.Recovery of infectious classical swine fever virus （CSFV） from full-length genomic cDNA clones by a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7 RNA polymerase[J]. Journal of Virological Methods， 1999（78）： 117.

【4】Li， C.， Huang， J.， Li， Y.， etc. Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from cloned cDNA using an RNA polymerase II system[J]. Archives of Virology ，2013（158）： 901-907.

【5】Meyers， G.， Thiel， H.J.， Rümenapf， T . Classical swine fever virus： recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic defective interfering particles[J]. Journal of Virology，1996（70）： 1588-1595.

【6】WU C W， CHIEN M S， HUANG C. Characterization of the swine U6 promoter for short hairpin RNA expression and its application to inhibition of virus replication[J]. J Biotechnol， 2013，168（1）：78-84.