加工番茄小孢子細胞學發育時期與花器形態相關性研究

單淑玲，龐勝群，郭曉珊，張國儒

(石河子大學農學院園藝系/特色果蔬生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】番茄(LycopersiconesculentumMill.)是茄科番茄屬一年生或多年生草本植物，根據其用途分為加工番茄和鮮食番茄兩類。世界第一大番茄制品出口國是中國，美國加州、中國新疆與地中海并列為世界三大番茄醬產區[1]。番茄屬于自花授粉植物，番茄花由花梗、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊組成，兩性花，聚傘花序，小果型品種多為總狀花序。影響單倍體育種成敗的關鍵因素之一是小孢子所處的發育時期[2]，研究小孢子發育時期與花器形態的相關性對單倍體育種有非常重要的意義。【前人研究進展】對園藝植物中紅棗[3]、辣椒[4]、青花菜[5]、火龍果[6]、蘿卜[7]和甘藍[8]等小孢子細胞學與花器形態相關性研究已有報道。【本研究切入點】目前，加工番茄常采用的育種方法為雜交育種，雜交育種獲得新品種(系)的周期較長。常見縮短育種周期，快速獲得植物新品種(系)的有效方法是植物單倍體育種。植物單倍體育種以花藥作為外植體利用花藥離體培養或游離小孢子培養技術將花藥培養成單倍體植株，將單倍體植株加倍成純合二倍體的育種方法。研究小孢子發育時期及花器官形態。【擬解決的關鍵問題】以加工番茄3個雜交種為材料，研究小孢子不同發育時期的花器形態與細胞學形態。確定小孢子不同發育時期的花器官形態，為加工番茄花藥培養提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

以加工番茄的3個雜交品種(P1×20040805、20040805×鉆石和P3×20040805文中分別用字母C1,C2和C3代替)為材料，試驗材料由石河子大學農學院園藝系蔬菜課題組提供。2017年8月將番茄種子催芽(溫湯浸種)后播種于50穴盤中，基質為草炭和蛭石按體積比為1∶1進行配置。待幼苗第四片真葉完全展開大概為35～40 d時，選取生長狀態一致的番茄幼苗定植于石河子大學農學院試驗站溫室。正常田間管理至番茄植株盛花期開始采樣。

1.2 方 法

1.2.1 花蕾和花藥形態觀察與測量

于晴天08:00～10:00(采蕾環境溫度范圍為15～18℃)，采摘加工番茄健壯植株上的花蕾裝入自封袋內做好標記并放入冰盒內快速帶回實驗室。將采摘的花蕾隨機抽取并用游標卡尺測量花蕾長度,每個品種按照花蕾長度,分為六個長度區間等級(3.00～3.99 mm；4.00～4.99 mm；5.00～5.99 mm；6.00～6.99 mm；7.00～7.99 mm和8.00及8.00 mm以上)，然后在解剖鏡下用鑷子剝去萼片、花瓣，取出花藥，觀察其顏色和形態特征。

1.2.2 花蕾細胞學觀察

將采摘好的花藥先用卡諾固定液(無水乙醇和冰醋酸體積比為3∶1)進行處理，在室溫下固定24 h后，取出花蕾放入小燒杯，用蒸餾水沖洗2～3次，置于70%乙醇中，放在4℃冰箱中備用。鏡檢時將處理好的花蕾，用鑷子剝去萼片、花瓣，取出花藥。先滴一滴醋酸洋紅染液在載玻片上，然后取2枚花藥放在染液上用鑷子擠碎花藥，并將多余的花藥壁等雜質夾出來。蓋上蓋玻片，將多余的醋酸洋紅染液用濾紙吸出。在數碼熒光倒置顯微鏡(Axio Observer.A1)下觀察，每個長度等級在顯微鏡下觀察100個不同視野，記錄每個視野中花粉細胞總數及單核靠邊期個數，并拍攝小孢子不同發育時期的照片。

1.3 數據處理

試驗數據采用用SPSS 18.0軟件進行處理，圖片采用IMAGE J軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 小孢子發育時期花器形態學特征

三個加工番茄品種均為聚傘花序，在種植過程中觀察發現，C1和C3始花期一致，而C2始花期較前者晚3 d，但不同品種加工番茄小孢子各發育時期對應花器官外部形態特征基本相同。研究表明，花蕾和花藥發育進程在花蕾大小，萼片顏色及花蕾閉合程度，花藥在顏色方面及剝離程度的變化。花蕾長度在3.00～4.99 mm時花蕾較小、閉合嚴密、萼片呈綠色；花藥為綠色難剝離；花蕾長度在5.00～6.99 mm時花蕾膨大、微微張開、萼片黃綠色；花藥為黃綠色易剝離 ；花蕾長度在7.00～8.00 mm以上時花蕾明顯膨大、張開、萼片黃色，花藥為黃色易剝離。圖1

2.2 小孢子發育時期的細胞學特征

研究表明，四分體時期是小孢子母細胞經過減數分裂產生，小孢子母細胞被一層厚厚的胼胝質包圍染色體解旋后形成四個核，然后四個核之間同時發生胞質分裂，分裂成由胼胝質壁包圍的四分孢子，即四分體。單核早、中期的花粉小孢子細胞體積變大，小孢子細胞中心有一個較大的細胞核，細胞有明顯的細胞壁且細胞質中未發現液泡。隨后花粉細胞體積持續增加，細胞呈正圓形，細胞核靠近細胞壁和顯現萌發孔，即單核靠邊期。單核靠邊期的后期進行有絲分裂，通過有絲分裂產生兩個細胞核，體積大的為營養核，靠近液泡；體積小的為生殖核，貼近花粉壁。圖2

注：圖1-A、1-B、1-C為3個品種花蕾外部形態圖；圖1-D、1-E、1-F從相對應的上排花蕾中解剖的花藥外部形態圖。(標尺=50 um)

Note: Figure 1-A, 1-B, 1-C are external morphological maps of three varieties of buds; Figure 1-D, 1-E, 1-F are external anatomical figures of anthers dissected from corresponding upper row buds. (Scale=50 um)

圖1 3個雜交組合加工番茄小孢子各發育時期花蕾和花藥外部形態
Fig.1 Processing tomato of buds and anther external morphology of tomato microspores in three hybrid combinations

注：A.四分體時期(40×10)；B. 單核早、中期 (40×10)；C.單核靠邊期(40×10)；D.雙核期(40×10)(標尺=20 um)

Note:A． Tetrad; B． Early and mid - uninucleate; C．uninucleate; D． Binucleate

圖2 加工番茄花粉小孢子各發育時期的細胞學特征
Fig.2 Cytological characteristics of pollen microspores at various developmental stages in processing tomato

2.3 花蕾長度與花粉小孢子單核靠邊期的關系

加工番茄雜交組合，不同花蕾長度不同的花粉小孢子單核靠邊期比例存在顯著性差異。C2和 C3這2個番茄品種的花蕾長度在5.00～5.99 mm 時與其它5個長度區組之間差異顯著，在該長度范圍內，2個加工番茄品種的單核靠邊期的小孢子所占比例分別為61.88% 和53.75%。C1品種的花蕾長度在6.00～6.99 mm 時與其它5個長度區組之間差異顯著，在該長度范圍內，單核靠邊期的小孢子所占比例為61.59% 。該番茄品種的花蕾長度在 3.00～3.99 mm與7.00～7.99 mm 和8.00及8.00 mm以上時，花粉小孢子的單核靠邊期比例在4%到10%之間，花粉小孢子單核靠邊期比例差異不顯著。但是當花蕾長為3.00～3.99 mm和8.00及8.00 mm以上時，此3個番茄品種的單核靠邊期比例基本都小于10%。雜交組合C1花蕾長度在6.00～6.99 mm 時，C2和C3花蕾長度在 5.00～5.99 mm花粉小孢子的單核靠邊期比例最高，可以將花蕾長度作為番茄花藥培養試驗研究中的采樣指標之一。表1

表1 不同花蕾長度區組的加工番茄花粉小孢子單核靠邊期比例
Table 1 Percentages of uninucleate microspores in anthers of Processing tomato at different developmental stages

花蕾長度Flower buds (mm)單核靠邊期比例 Percentages of uninucleate microspores (%)C1C2C33.00～3.993.21 ±0.10Dd6.62 ±0.20Cc10.83±0.26Dd4.00～4.9917.41±0.33Cc30.71±0.37Bb20.37±0.35Cc5.00～5.9943.27±0.40Bb61.88±0.33Aa53.75±0.39Aa6.00～6.9961.59±0.32Aa27.70±0.33Bb36.24±0.38Bb7.00～7.9910.71±0.25CDcd14.68±0.24Cc22.45±0.32Cc8.00及8.00以上4.54±0.18Dd5.80±0.18Cc7.32±0.19Dd

注: 不同小寫字母表示在 0.05水平下差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平下差異顯著

Note: Different lowercase letters expressed significant difference at the 0.05 level，different capital letters expressed significant difference at the 0.01 level

3 討 論

3.1 小孢子發育時期與花器形態的相關性

加工番茄小孢子的發育階段與花器各項形態指標具有相關性，不同品種加工番茄相同小孢子發育時期所對應的花器外部形態存在一定的差異。前人研究發現[9-11]，當花藥為綠色且花藥末端略帶淡紫色時，小孢子的發育時期在單核期與雙核早期之間，處于第一次有絲分裂時期，小孢子比較有可能向單倍體方向發育。研究發現當小孢子處于單核靠邊期時，花蕾和花藥的形態特征是：花蕾膨大、微微張開、萼片黃綠色，花藥顏色為黃綠色易剝離。

3.2 小孢子發育時期的細胞學特征

試驗小孢子發育時期的觀察采用醋酸洋紅染色法，通過在顯微鏡下觀察花粉小孢子的發育情況，對小孢子不同發育時期的細胞學特征進行研究。通過顯微鏡觀察，發現加工番茄小孢子發育時期大致分為四個時期。每個時期可以根據細胞核的數量，位置以及其他明顯特征進行簡單的區分。此外，彭真、張永華等均研究發現[12-13]，四分體時期是小孢子母細胞分裂成由胼胝質壁包圍的四分孢子，即四分體時期；單核早、中期的花粉小孢子細胞中心有一個較大的細胞核，細胞有明顯的細胞壁且細胞質中未發現液泡細胞呈正圓形；細胞核靠近細胞壁和顯現萌發孔，即單核靠邊期；雙核期產生兩個細胞核，體積大的為營養核，靠近液泡，體積小的為生殖核，貼近花粉壁。

3.3 花蕾長度與花粉小孢子單核靠邊期的關系

利用花藥培養技術可獲得單倍體或純合二倍體植株，可縮短育種年限，但是不是任何發育時期的花粉小孢子在培養基培養時能誘導產生胚狀體或愈傷組織。只有發育到特定的時期，加工番茄小孢子較適宜的時期為單核靠邊期。此外，在園藝植物甘藍中發現，花蕾長度在 4.5～5.49 mm 時，小孢子多數處于單核靠邊期，較容易誘導出胚狀體[14]。江偉等[15]在大白菜游離小孢子培養中得出，當花蕾長度在 2.0～2.5 mm，單核靠邊期比例高，產胚量最高。就多數植物而言,單核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織。一般認為花蕾的長度、瓣藥比是判斷小孢子發育階段的可靠指標[16]。試驗通過鏡檢發現雜交組合C1花蕾長度在 6.00～6.99 mm 時，C2和 C3花蕾長度在 5.00～5.99 mm花粉小孢子大多數處于單核靠邊期，因此，可以將花蕾長度作為加工番茄取材時期的參考指標。

4 結 論

不同品種加工番茄相同小孢子發育時期所對應的花器外部形態存在一定的差異。雜交組合C1花蕾長度在 6.00～6.99 mm 時，C2和 C3花蕾長度在 5.00～5.99 mm花粉小孢子大多數處于單核靠邊期。此時花蕾外觀和花藥的形態特征是：花蕾膨大、微微張開、萼片黃綠色，花藥顏色為黃綠色易剝離。影響花藥培養的因素之一是花粉發育時期，花粉發育時期與花蕾或花藥形態密切相關，對于花藥離體培養來說不是任何發育時期的小孢子都合適。前人對小孢子發育時期的研究認為[17-20]，小孢子處于單核后期時，花藥培養比較容易成功。此外，在大規模的植物組培生產過程中，利用顯微鏡觀察每一個花蕾所處小孢子發育時期是不可能的。在進行加工番茄單倍體育種時，可以根據此時期的特點，通過測量加工番茄花蕾長度，鑒定小孢子的發育時期。

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