雙指標優化黑曲霉液態發酵條件及降解棉稈效果

郭 凱，侯 敏，包慧芳，王 寧，詹發強，楊 蓉，楊文綺，龍宣杞，崔衛東

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】纖維素酶是一類能降解纖維素?-1,4一葡萄糖苷鍵，將纖維素分解成纖維寡糖，纖維二糖和葡萄糖等多組分的總稱[1-2]。根據纖維素酶的結構特性和各組分功能，可以將其劃分為三大類[3-5]：外切葡聚糖酶，內切葡聚糖酶和?-葡萄糖苷酶。測定纖維素酶活力時，一般通過測定內切葡聚糖(羧甲基纖維素酶)來表征纖維素酶樣品的糖化能力，但是其不能代表總纖維素酶活力高低。總酶活是以不溶性纖維素濾紙為底物來測定。濾紙酶活力可表征菌株分解纖維的能力及其纖維素酶系3類酶組分的協同作用[6-7]。1987 年，國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)確認并公布 FPase 力測定法為標準方法[8-10]。【前人研究進展】響應面方法(Responsesurfacemethodology)是利用合理的試驗設計，通過試驗所得出的數據，采用多元二次回歸方程來建立因素與響應值之間的函數關系，通過分析來尋找最優參數，能充分考慮各因素之間的交互作用。因而，將響應面法應用于微生物培養基的優化工作有重要的意義[11-12]。【本研究切入點】目前有很多關于黑曲霉產纖維素酶液體發酵條件研究，但大多以CMCase為指標，不能完全說明黑曲霉總的酶活力[13-14]。研究借助Desigin-Expert軟件，以FPAase和CMCase為指標，對黑曲霉產纖維素酶液體發酵條件進行優化。【擬解決的關鍵問題】通過雙指標利用響應面法優化黑曲霉液體發酵的產酶能力，分析黑曲霉產纖維素酶能力，提高黑曲霉對棉花秸稈降解作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種

黑曲霉ZD由新疆農業科學院微生物應用研究所分離，現保藏于新疆農業科學院微生物應用研究所菌種室。

濾紙：濾紙為雙星濾紙，將濾紙剪成1 cm×6 cm，質量為(50±0.5) mg的小條，用1%醋酸浸泡24 h，用碘液檢查確定無淀粉后，用2%碳酸氫鈉洗至中性，晾干備用。

葡萄糖標準液：稱取無水葡萄糖1 g(精確至0.001)，加檸檬酸鹽緩沖液溶解，定容至100 mL。

1.1.2 培養基

PDA培養基[15-16]：馬鈴薯200 g、瓊脂15～20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸0.5 h，然后用紗布過濾，再加糖，融化后補足水至1 000 mL。121 ℃、30 min滅菌(液體培養基不用加瓊脂)。

斜面培養基：PDA培養基。

種子培養基：PDA液體培養基；

產酶初始液體培養基[17]： CMCNa 1 g/100 L，蛋白胨0.5 g/100 mL，硫酸鎂0.05 g/100 mL，磷酸氫二鉀0.1 g/100 mL。

1.2 方 法

1.2.1 培養

將菌株接種于PDA培養基上，28℃培養96 h后，用接種環刮取表面孢子獲得孢子一環并接入100 mL種子培養基(250 mL三角瓶)中，30℃、150 r/min培養48 h后得種子液，再將種子液以5%的接種量接入液體產酶培養基(250 mL搖瓶)，30℃、150 r/min培養168 h[18]。

1.2.2 標準曲線制備

量取葡萄糖標準液0、2、3、4、6、8、10 mL，用檸檬酸鹽緩沖液定容至50 mL，配成濃度為0～2 mg/mL系列。

分別吸取葡萄糖標準系列溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，各加2 mL水和3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫，用水定容至25 mL，在540 nm波長下測光密度值(OD值)，并用葡萄糖含量(mg)與測定值(OD)作圖，即為標準曲線y=0.009 6x-0.029 4(R2=0.992 7)，式中：y為葡萄糖含量(mg/mL)，x為酶解反應產物溶液經顯色后所測的OD540nm值。R2=0.992 7說明在葡萄糖質量濃度和吸光度值在一定范圍內線性關系較好[19-20]

1.2.3 酶活力

將酶相對比活力較高的菌株制備菌懸液，取 10 mL，12 000 r/min，離心10 min，上清液即為粗酶液。

羧甲基纖維素酶活力測定：取 2 mL羧甲基纖維素溶液于 25 mL刻度試管中，加 0.5 mL粗酶液，混合均勻，50℃，水浴30 min后，再加入 3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，定容25 mL，在540 nm 下測定其吸光值(A540)。酶活力計算：以每1 min產生1 μmoL還原糖定義為1個酶活力單位(U)。對照組為 100℃水浴滅活 5 min的粗酶液。

羧甲基纖維素鈉酶活力(U/mL)=葡萄糖含量(mg)×5.56/反應液中酶的添加量(mL)×時間(h)。

式中：5.56代表1 mg葡萄糖物質的量。

濾紙酶活力測定[21]：取4支洗凈烘干的25 mL具塞刻度試管(一支空白管，三支樣品管)，編號后將濾紙條卷成小卷，分別放入四支試管的底部，分別向四支管中各加入質量分數為1%的檸檬酸鹽緩沖液1.5 mL，分別準確加入稀釋好的待測酶液0.5 mL于三支樣品管中(空白管不加)，使管內溶液浸沒濾紙，蓋塞。將四支試管同時置于(50±0.1)℃水浴中，準確計時，反應60 min，取出。反應完畢后迅速、準確地向各管中加入DNS試劑2 mL，于空白管中準確加入稀釋好的待測酶液0.5 mL，搖勻。將四支管同時放入沸水浴中，準確計時，加熱5 min，取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25 mL。以空白管 (對照液)調儀器零點，在分光光度計波長540 nm下，分別測量三支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過查標準曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。酶活力單位定義為1 h水解生成1 mg的酶量定義為1個酶活單位。

濾紙酶活力(U/mL)=葡萄糖含量(mg)×5.56/反應中酶液的添加量(mL)×反應時間(h)

公式中5.56代表1 mg葡萄糖物質的量。

1.2.4 液體發酵條件下棉稈纖維素和半纖維素

將最優條件下獲得的黑曲霉菌液，以10%接種量接入含有棉花秸稈作為唯一碳源的液體培養基，測定其第3、5、7、10、15、20、30 d的纖維素(Cellulose，C)含量和半纖維素(Hemicellulose，HC)含量，并計算降解率。按照Van Soeat法測定纖維素和半纖維素含量[22-23]。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

1.2.1.1 單因素試驗

分別對碳源1%(CMCNa、蔗糖、葡萄糖、微晶纖維素、淀粉)、氮源0.5%(酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨)、無機鹽0.1%(K2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4)、培養時間(72、96、120、144、168、196 h)、溫度(25、30、35℃)、轉速(125、150、175、200 r/min)、接種量(3、5、7、9、11%)進行單因素試驗。在初始pH 7.0、30℃、150 r/min，144 h的培養條件下，進行單因素試驗的初步優化。

1.2.1.2 Plackett-Burman(PB)設計

分別選取以上7個因素的高低2個水平，通過Design-Expert軟件選用Factors=7，Runs=12的PB設計，以CMCase和FPAase為響應值。通過比較各因素的顯著性水平，篩選出對產酶影響較為顯著的因素[24-25]。

1.2.1.3 Box-Benhken中心組合設計

用中心組合設計進行響應面試驗，通過試驗數據擬合響應面模型，得到二次多項式，并確定最佳發酵條件。二次多項式為描述響應量(應變量)和自變量關系的經驗模型。

1.3 數據處理

所有處理做3個重復，用Origin做試驗數據的誤差分析，用Design-Expert對PB試驗和中心組和設計進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

研究表明，得到線性回歸曲線為：y=0.009 6x-0.029 4，R2=0.992 7，說明曲線可信度較高，可以應用。不同濃度的葡萄糖溶液在540 nm處測定的吸光度值為，當葡萄糖含量0、20、30、40、60、80和100 mg/mL時，OD值為0、0.152、0.243、0.342、0.524、0.794和0.921。圖1

圖1 葡萄糖標準曲線
Fig.1 Glucose standard curve

2.2 單因素試驗篩選結果

研究表明，在碳源為淀粉、氮源為蛋白胨、無機鹽K2HPO4、培養時間168 h、接種量7%、轉速150 r/min和溫度30℃時，黑曲霉ZD分別產纖維素酶的能力較優，對篩選出來的水平進行PB設計。圖2

圖2 各因素下黑曲霉ZD產酶變化
Fig.2 Effects of medium composition and fermentation conditions on cellulase production

2.3 PB試驗設計及優化

研究表明，模型的P值為0.043 2<0.05，模型選擇正確。由變量顯著性P值顯著性大小可知，蛋白胨質量濃度(P=0.022 3)，轉速(0.040 2)，接種量(P=0.007 7)，P值均小于0.05，對CMC酶活力影響顯著，且接種量>蛋白胨質量濃度>轉速。其他因素對CMC酶活影響不顯著；模型的P值為0.010 9<0.05，模型選擇正確，由變量顯著性可知，淀粉質量濃度(P=0.009)和接種量(P=0.020 6)，P值均小于0.05，對FPA酶活影響顯著，且淀粉質量濃度>接種量。由以上對CMC酶活和FPA酶活的PB試驗方差分析，選擇淀粉質量濃度、蛋白胨質量濃度、接種量和轉速進行下一步的優化。表1～4

表1 Plackett-Burman試驗因素水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

因素Factor水平 Level-11淀粉質量濃度X1(g/100 mL) Starch mass concentration11.5蛋白胨質量濃度X2(g/100 mL) Peptone mass concentration0.50.75K2HPO4質量濃度X3(g/100 mL) K2HPO4 mass concentration0.10.15培養時間X4(h) Training time168252轉速X5(r/min) Speed150175溫度X6(℃) Temperature3037接種量X7(%) Inoculum size710

表2 PB試驗設計及其結果
Table 2 Experimental design and responses of Plackett-Burman design

試驗號Test numberX1淀粉StarchX2蛋白胨PeptoneX3(K2HPO4)X4培養時間Training timeX5轉速SpeedX6溫度TemperatureX7接種量Inoculum sizeCMC酶活力Carboxyme-thylcellulose sodium enzyme activity (U/mL)FPA酶活力Filter paper enzyme activity(U/mL)111-1-1-11-1408.667162.202-1-1-1-1-1-1-1399.393144.863-1111-1-1-1390.744140.234-1-1-11-111422.563160.315-111-1111400.169161.4761-1-1-11-11410.971181.707-1-11-111-1412.128151.57811-1111-1382.173174.219-11-111-11388.968146.78101-1111-1-1422.945177.80111-111-111378.923182.3212111-1-1-11402.676176.53

表3 CMC酶活PB試驗方差
Table 3 ANOVA analysis for PB experimentation

方差來源Source平方和Sum of square自由度df均方Mean squareF值F valueP值p-value模型 Model225.72732.256.640.043 2A-淀粉質量濃度 Starch mass concentration0.02110.0214.41E-030.950 2B-蛋白胨質量濃度 Peptone mass concentration63.68163.6813.110.022 3C-K2HPO4質量濃度 K2HPO4 mass concentration0.1410.140.0280.874 7D-培養時間 Training time119.11119.124.520.773 3E-轉速 Speed42.27142.278.70.042F-溫度 Temperature0.05210.0520.0110.922 3G-接種量 Inoculum size0.4610.460.0950.007 7殘差 Residual19.4344.86總值 Total245.1411

表4 FPA酶活PB試驗方差
Table 4 ANOVA analysis for PB experimentation

方差來源Sources平方和Sum of square自由度df均方Mean squareF值F valueP值p-value模型 Model2 404.487343.514.290.010 9A-淀粉質量濃度 Starch mass concentration1 863.4711863.4777.510.000 9B-蛋白胨質量濃度 Peptone mass concentration115.011115.014.780.094 0C-K2HPO4質量濃度 K2HPO4 mass concentration32.84132.841.370.307 4D-培養時間 Training time0.9210.920.0380.854 7E-轉速 Speed61.07161.072.540.186 2F-溫度 Temperature48.69148.692.030.227 8G-接種量 Inoculum size282.481282.4811.750.026 6殘差 Residual96.17424.04總值 Total2 500.6611

2.4 Box-behnken組合設計

采用Box-behnken組合設計建立數學模型，以淀粉質量濃度，蛋白胨濃度、接種量和轉速作自變量，以-1、0和1分別代表低、中和高水平，測定CMC酶活和FPA酶活，采用加權評分法，以加權綜合評分為響應值，以CMC酶活最大值430.543，FPA酶活最大值179.989為參照，綜合評分=(CMC酶活/430.543)×50+(FPA酶活/179.989)×50。利用Desigin-expert對試驗結果進行回歸分析，得回歸方程為：綜合評分=96.399 34+1.320 17×X1+0.113 13×X5+0.690 86×X7+4.191 98×X1X7-3.329 32X12+1.715 73×X52-3.145 26×X72。

通過Design-Expert軟件試驗數據和模型進行分析，所選模型P值<0.000 1，小于0.01，極顯著，方程擬合度較好；失擬項反應的是試驗數據與模型不相符的情況，失擬項P值=0.499 0，大于0.05，不顯著，模型選擇正確，可以預測試驗結果。相關系數R2=0.810 2，校正決定系數R2=0.982 4，可以解釋81.02%的變量，回歸方程可以較好解釋各因素與響應值的關系。變異系數CV=1.79，數值較低，說明試驗精確度較高，操作可信。信噪比=15.55>4，說明有效值遠遠大于無效值。表5～6

表5 Box-Behnken組和設計方案及結果
Table 5 Experimental design and response of Box-Behnken design

試驗號Testnumber因素X1淀粉質量濃度Starch mass concentration(g/100 mL)X2蛋白胨質量濃度Peptone mass concentration(g/100mL)X5轉速Speed(r/min)X7接種量Inoculum sizeCMC酶活Carboxyme-thylcellulose sodium enzyme activity (U/mL)FPA酶活Filter paper enzyme activity(U/mL)綜合評分Overall rating11(1.5)0(0.5)-1(130)0(7%)430.543171.56397.6620(1)00(150)0380.504175.34492.90301(0.75)0-1(5%)425.551179.98999.4240-1(0.25)-10(9%)389.098169.39892.255101(170)0421.297168.38495.7060000423.982165.56895.237-1(0.5)010383.253143.99184.5180-101432.290178.93199.919-100-1403.937160.23691.42101001426.234177.29498.75111-100408.495176.30996.4212001-1429.881164.26295.55130-10-1425.347178.39698.9514-1-100410.004159.33291.88150101428.596178.95399.26160110425.045158.29793.34170000382.152178.98096.10180000392.243175.65494.351901-10426.240169.26896.52200011384.339173.68092.8821100-1413.332162.22693.07221100403.225165.88392.912300-1-1382.290177.59293.7324-1001395.880172.19493.81250-110415.478166.33994.46260000423.432174.65297.6927-10-10403.943161.11691.672800-11411.596163.69193.2729-1100387.286175.79393.81

表6 回歸方程方差
Table 6 ANOVA analysis for regression equation

來源Source平方和Sum of square自由度df均方Mean squareF值F valueP值p-value模型 Model235.499 3926.166 599.115 499< 0.000 1A-淀粉質量濃度 Starch mass concentration14.954 6114.954 65.209 6470.034 2B-蛋白胨質量濃度 Peptone mass concentration0.216 00810.216 0080.075 250.786 8C-X5 轉速 speed0.853 34110.853 3410.297 2730.591 9D-X7 接種量 Inoculum size7.001 40717.001 4072.439 0390.134 9AD50.341 98150.341 9817.537 340.000 5A264.594 08164.594 0822.502 260.000 1B211.651 83111.651 834.059 0790.058 3C230.860 33130.860 3310.750 630.003 9D267.642 07167.642 0723.564 070.000 1殘差 Residual54.540 64192.870 56失擬項 Lack of Fit39.721 671426.166 590.957 3070.569 8純誤差 Pure Error14.818 97914.954 6Co總值 r Total290.039 91復相關系數 R-squared0.810 2校正相關系數 Adj-squared0.722 9變異系數 C.V. (%)1.789 017信噪比 Adeq Precisior15.553 65

研究表明，等高線圖反映因素間的交互作用，研究等高線圖為橢圓形代表相互作用顯著，表示淀粉質量濃度和接種量之間交互作用顯著，淀粉質量濃度和接種量的交互作用對綜合酶活力影響顯著。利用Design-Expert軟件，對方程式進行分析和優化，淀粉質量濃度、蛋白胨質量濃度，轉速和接種量的最優試驗點編碼值為X1，X2，X5，X7(0.42，-1.00，0.99，0.38)，即淀粉質量濃度為1.21 g/100 mL，蛋白胨質量濃度0.25 g/100 mL，轉速169.8 r/min，接種量7.76%。此方程綜合評分的最大預測值為100.004。考慮實際限制，修正為淀粉質量濃度1.21 g/100 mL，蛋白胨質量濃度0.25 g/mL，轉速170 r/min，接種量7.8%。圖3

2.5 模型驗證

研究表明，初始培養條件下(CMC-Na 1 g/100 mL，蛋白胨0.5 g/100 mL，磷酸氫二鉀0.1 g/100 mL，培養時間144 h，轉速150 r/min，溫度30℃，接種量5%)；優化后的條件是淀粉質量濃度1.21 g/100 mL，蛋白胨質量濃度0.25 g/mL，磷酸經二鉀 0.1 g/100 mL，培養時間168 h，轉速170 r/min，接種量7.8%，將菌株分別在初始培養條件下和優化后的培養條件下，進行產酶試驗并進行比較。初始條件培養后所得CMC酶活260.335 U/mL，FPA酶活155.946 U/mL，綜合評分為73.55；優化后條件培養所得CMC酶活435.449 U/mL，FPA酶活183.654 U/mL，綜合評分為100分，與預測條件基本一致，比初始條件下培養高出了35.96%。

2.6 液體發酵下棉稈降解效果

研究表明，經過優化后的黑曲霉產酶菌液，通過液體發酵對棉稈的纖維素和半纖維素有一定程度的降解。在接種菌液后的前7 d，棉稈中纖維素含量和半纖維素含量基本沒有發生變化，到第7 d時，開始有了變化，纖維素和半纖維素開始降解，棉稈中的纖維素和半纖維素含量開始降低，降解率也開始變大。到第30 d時，棉稈中纖維素含量由最初的40.2%降到28.5%，最高降解率為28.03%；半纖維素含量也由最初的11.6%降到7.9%，最高降解率為31.90%。在整個發酵期間，與未加菌液對照組相比，纖維素和半纖維素含量顯著降低，對照組的纖維素和半纖維素含量幾乎無變化。圖4

圖3 淀粉質量濃度和接種率對酶活的綜合影響的交互作用的響應面和等高線
Fig.3 Response surface and contour plots of the interaction of starch mass concentration and inoculation rate on the combined effects of enzyme activity

圖4 液體發酵過程中棉稈中纖維素含量、半纖維素含量和降解率變化
Fig.4 Changes of cellulose content, hemicellulose content and degradation rate in cotton straw during liquid fermentation

3 討 論

3.1 CMC酶活只是代表了纖維素酶的一種，想要提高菌株產纖維素酶的能力，需要對多種酶活進行優化。以往的研究，只以CMC酶活作唯一指標，不能代表纖維素酶的整體酶活力。馮培勇等[26]以CMCase為指標，在最優條件下酶活達到360.03 U/mL；劉松等[27]通過響應面法，以CMCase為指標，在最優條件下酶活達到63.5 U/mL；白愛枝等[28]以玉米芯為碳源產纖維素酶水平較高,用量以80 g/L為宜,氮源以6 g/L的蛋白胨效果為最佳;麥芽糖作為速效碳源,可供菌體早期迅速生長并產酶,以10 g/L為宜;研究還發現,用中和劑CaCO3可有效地調控發酵pH,提高產酶能力,容氧和發酵溫度以30 mL/250 mL三角瓶和28℃為宜,200 r/min發酵培養72 h達到產酶高峰。經優化后菌株產纖維素酶的活力較優化前提高150%以上。以上研究都僅僅以CMC酶活為指標，只表征了內切葡聚糖酶活力。

3.2 棉稈纖維素降解一直阻礙棉稈飼料的應用，優化具有高效產纖維素酶能力的菌株對于棉稈纖維素降解有很大價值。近年來些關于棉稈降解的研究，都是采取細菌來降解棉花秸稈的纖維素。侯敏等[29]枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis),與產朊假絲酵母(Candidautilis)、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)構建復合菌系按1∶1∶2∶1進行發酵, 纖維素降解率達35.91%,接種量對纖維素降解率影響最大。席琳橋等以地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenniformis)、面包乳桿菌(Lactobacilluscrustorum)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、于酪乳桿菌(Lactobacilluscase)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、腸球菌屬(Enterococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，建立青貯乳酸菌系降解棉花秸稈，棉稈中半纖維素被降解42.69%,纖維素被降解44.30%,木質素被降解30.45%[29]。

4 結 論

4.1 碳源為淀粉，氮源為蛋白胨，無機鹽為K2HPO4，培養時間為168 h，轉速為150 r/min，溫度為30℃，接種量為7%；再利用PB試驗篩選出淀粉質量濃度，蛋白胨質量濃度，轉速和接種量為主要影響因素；通過Box-Benhken試驗設計，對主要因素進行優化后，確定淀粉質量濃度1.21 g/100 mL，蛋白胨質量濃度0.25 g/100 mL，轉速170 r/min和接種量7.8%，CMC酶活435.449 U/mL，FPA酶活183.654 U/mL，綜合評分為100分，比未優化的高35.96%(CMC酶活435.449 U/mL，FPA酶活155.946 U/mL，綜合評分73.55分)。

4.2 將優化后的黑曲霉菌液，轉接到以棉稈為唯一碳源的液體培養基，測定第3、5、7、10、15、20、30 d棉稈中的纖維素和半纖維素，纖維素含量從最初的40.2%降到28.5%，半纖維素從最初的11.6%降到7.9%，第30d纖維素降解率達到28.03%，半纖維素降解率達到31.09%，表明黑曲霉對棉稈中纖維素降解有著顯著作用。

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