1株陽離子藍染料高效脫色菌的分離鑒定及特性研究

張 璐，張崇淼*，牟 霄，張琪雯

(1.西安建筑科技大學 環境與市政工程學院 西北水資源與環境生態教育部重點實驗室 陜西省環境工程重點實驗室，陜西 西安 710055；2.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710065)

陽離子染料又稱堿性染料或鹽基性染料，主要用于腈綸纖維的染色。根據染料分子中陽離子電荷與發色團共軛體的組成形式，可將其劃分為隔離型和共軛型兩大類[1]，絕大多數陽離子染料屬于后者。陽離子藍是共軛型陽離子染料的典型代表，具有著色力強、耐曬牢度高等優點，其發色團共軛體中有偶氮鍵、芳環和含氮雜環[2]。我國是陽離子染料生產和使用的主要國家，每年產量占染料生產總量的20%～30%。陽離子染料在生產和使用過程中容易流失[3]，廢水的色度高達幾萬至幾十萬，可生化性差[4]，給環境治理帶來嚴重威脅。目前用于處理陽離子藍染料廢水的方法包括吸附法[5-6]、氧化法[7-9]和電化學法[10-11]等，但大都存在處理成本高、易造成二次污染的缺點。采用生物處理技術可以有效地解決上述問題，但由于陽離子染料難生化降解的特性，故常需要使用特定的功能菌才能實現良好的處理效果。近年來的研究發現了對陽離子染料具有良好脫色效果的微生物，例如假單胞菌(Pseudomonas)[12-13]、庫特氏菌(Kurthia)[14]、棒狀桿菌(Coryneforms)[15]等，但它們對脫色條件要求較嚴格，達到良好脫色效果所需時間較長，對染料濃度的耐受能力十分有限，這在很大程度上限制了其推廣應用。因此，尋找適應性強、對陽離子染料具有快速高效脫色性能的微生物，進一步開發陽離子染料生物處理技術具有重要的意義。陽離子藍是一種色澤濃艷的偶氮類水溶性染料，在腈綸的染色和印花中使用量非常大，但目前鮮有陽離子藍染料脫色菌的報道。本研究針對陽離子藍染料篩選分離脫色菌，利用16S rDNA分析比對法進行種屬鑒定。通過在不同條件下的脫色試驗研究該菌株的脫色特性和影響因素，并對其連續脫色性能進行考察，以期為該脫色菌的工業化應用提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 染料 選用的染料為陽離子藍SD-GSL，購自蘇州市東吳染料有限公司。染料的陽離子是含有偶氮基的發色基因，其化學式為C19H23N4SO，結構式如圖1所示，相對分子質量為355，在水溶液中的最大吸收波長587 nm。

圖1 陽離子藍SD-GSL的陽離子結構式Fig.1 Structural formula of cation of cationic Blue SD-GSL

1.1.2 培養基 富集培養基：牛肉膏 5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，pH調整至7.0±0.2；馴化培養基：在富集培養基中加入不同濃度的陽離子藍SD-GSL；陽離子藍培養基：在富集培養基中加入陽離子藍SD-GSL，終濃度為300 mg/L；陽離子藍平板培養基：陽離子藍染料培養基中加入瓊脂，質量分數為1.5%。

1.2 方法

1.2.1 陽離子藍脫色菌的篩選與分離 取長期受到工業污染的土壤10 g，置于盛有90 mL無菌水的錐形瓶內，室溫120 r/min振蕩2 h，將懸濁液靜置30 min，使顆粒物沉淀。取10 mL上清液與90 mL富集培養基混合，37 ℃ 150 r/min振蕩培養12 h。取培養液10 mL轉入含100 mL馴化培養基的錐形瓶中，進行陽離子藍濃度壓力馴化培養，陽離子藍濃度范圍為50～400 mg/L，遞增梯度為50 mg/L。最終馴化培養獲得的菌液轉至富集培養基中培養12 h，然后在陽離子藍培養平板上劃線分離，挑取單菌落保存備用。

1.2.2 菌種鑒定 挑取平板上的菌落至無菌水中，置于95 ℃金屬浴5～10 min后，離心取含有菌株DNA的上清液作為模板。使用16S rDNA通用引物(上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTT-ACGACTT-3′)進行聚合酶鏈反應。PCR反應體系(50 μL)：無菌水34 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL(2.5 mmol/L)，MgCl23 μL(25 mmol/L)，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，TaqDNA聚合酶1 μL(2.5 U/μL)，模板1 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min(30個循環)；72 ℃ 7 min。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳初步確定后交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。利用美國國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序在GenBank數據庫中對測序結果進行同源性比對分析。

1.2.3 脫色菌生長曲線的繪制 取富集培養的菌液，以富集培養基為參比，在波長600 nm處每隔 2 h測定OD600，以培養時間為橫坐標，菌液的OD600值為縱坐標繪制菌株的生長曲線。

1.2.4 脫色實驗和脫色率測定 取10 mL富集培養的菌液接種于90 mL陽離子藍培養基中，振蕩培養(37 ℃，150 r/min)進行脫色實驗，每隔一段時間測定脫色率。脫色率測定方法：將脫色后的試樣離心(10 000 r/min，10 min)取上清液，以富集培養基為參比，在587 nm處測定吸光度A1。以未加菌液的含相同陽離子藍染料濃度的培養基作為空白，測定吸光度A0。按照下式計算菌株對陽離子藍的脫色率。

使用終濃度為300 mg/L的陽離子藍培養基進行脫色實驗，每隔2 h測定脫色率，以培養時間為橫坐標，脫色率為縱坐標繪制脫色曲線。調整培養基初始pH、溫度、轉速，脫色24 h后取樣測定脫色率，考察這些因素對菌株脫色性能的影響，每組3次平行。

1.2.5 連續脫色實驗 取10 mL菌液接種于90 mL 300 mg/L陽離子藍培養基中，在pH、溫度、轉速均為最佳條件下進行連續脫色，每隔12 h測定吸光度，計算脫色率。根據脫色液中剩余陽離子藍染料濃度在試樣中補充陽離子藍至終濃度300 mg/L，再開始下一次脫色實驗。連續進行5次脫色實驗，比較脫色率的變化，每組3次平行。

1.2.6 脫色途徑實驗 將富集培養12 h后的菌液分為2份，一份直接接種于陽離子藍培養基中進行脫色實驗，另一份則先高壓蒸汽滅菌20 min后再進行脫色實驗，每隔12 h測定脫色率。分別在脫色 0、6、12、24、48 h取上清液，離心后在波長200～800 nm范圍內掃描吸收光譜。

2 結果與分析

2.1 脫色菌株的鑒定

經篩選分離后獲得1株對陽離子藍具有高效脫色能力的細菌，命名為ZHT-3。對菌株ZHT-3的16S rDNA 進行PCR擴增后測序，獲得402 bp的核酸片段。經比對分析，該核酸片段序列與蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)16S rDNA同源，一致性(identity)高達99%(表1)。結合該菌的菌落形態特征，初步判定菌株ZHT-3為蠟狀芽胞桿菌，獲得序列號MG738794。

表1 菌株ZHT-3的16S rDNA部分序列與GenBank中其他序列的同源性比對Table 1 Homology comparison of 16S rDNA partial sequence of strain ZHT-3with other sequences located in GenBank

2.2 菌株ZHT-3的生長曲線和脫色曲線

菌株ZHT-3在陽離子藍培養基中測得的脫色曲線與在富集培養基中測得的生長曲線的變化趨勢基本一致(圖2)。在不含陽離子藍的富集培養基中，菌株ZHT-3沒有明顯的遲緩期，對數生長期大約持續到8 h，然后進入穩定生長期，菌液的OD600在30 h達到峰值，而在8 h即達到峰值的86.6%。王震文[16]從紡織廢水中篩選得到用來降解偶氮染料的芽胞桿菌ACT1在24 h時就進入衰亡期，相比之下ZHT-3世代時間長，有利于穩定脫色。在初始濃度300 mg/L陽離子藍培養基中，菌株ZHT-3在8 h內脫色率急劇增加，8 h即達到76.3%。由此可見，菌株ZHT-3對陽離子藍的脫色主要是在對數生長階段完成的，此時菌體

圖2 菌株ZHT-3的脫色曲線和生長曲線

具有較高的脫色活性，其結果與高效脫色偶氮染料活性黑5的混合菌群FF[17]有類似的作用規律，這一特性意味著該菌株可以實現對陽離子藍的快速脫色。8 h后隨著菌體的生長，脫色率逐漸增高，在30 h達到了最高脫色率98.8%。由圖2還可以看出，陽離子藍的脫色率在菌體進入穩定期后增長很緩慢，可能由于染料的中間代謝產物對菌體產生毒性，從而抑制菌株脫色。

2.3 菌株ZHT-3對陽離子藍的脫色性能

菌株ZHT-3在不同初始染料濃度的培養基中對陽離子藍的脫色率隨時間的變化情況如圖3所示。當陽離子藍初始濃度在500 mg/L以內時，菌株ZHT-3都能夠達到95%以上的脫色率，且能夠長時間保持，但達到時間會隨著初始濃度的升高而延長。例如對于100 mg/L初始濃度的陽離子藍，菌株ZHT-3在12 h就達到96.7%；而對于500 mg/L初始濃度的陽離子藍，則需要36 h才能達到95.4%的脫色率。當陽離子藍初始濃度升至600 mg/L時，菌株ZHT-3最大脫色率為70.6%。可以看出菌株對染料的脫色率隨著染料初始濃度的增加而降低，且達到最高脫色率的時間也隨之延遲，推測可能是隨著陽離子藍初始濃度的升高，染料的生物毒性越強，對菌體生長以及產生偶氮還原酶活性的抑制作用也逐漸增強，導致脫色能力的明顯下降。Hadi等[13]分離得到的銅綠假單胞菌對200 mg/L以上濃度范圍內的甲基藍24 h脫色率最高為43.08%。林麗英[14]篩選出對陽離子翠藍具有脫色能力的庫特氏菌108#在125 mg/L下24 h脫色率僅為49.27%。與這些研究結果進行對比可以發現，菌株ZHT-3對高濃度陽離子藍染料的脫色性能明顯優于以往報道的脫色菌。

圖3 菌株ZHT-3對不同初始濃度陽離子藍的脫色率Fig.3 Decolorization rate of strain ZHT-3 in different initial Cationic Blue SD-GSL concentration

微生物的連續脫色能力是其能否應用到實際廢水處理的重要指標。隨著脫色時間和次數的延長，代謝產物和有毒物質逐漸積累，在反應液的單位體積內的濃度越來越高，導致微生物脫色性能的下降。菌株ZHT-3對陽離子藍連續脫色實驗中脫色率的變化(圖4)基本呈現出這一趨勢，但在前兩次連續脫色實驗中脫色率還有所升高，達到95.4%，之后才逐漸降低。連續脫色3次，脫色率仍保持在79.2%。這說明菌株ZHT-3對陽離子藍有較為持久的脫色性能，有利于實際應用。

圖4 菌株ZHT-3對陽離子藍連續脫色實驗的脫色率Fig.4 Continuous repeated batch decolorization of Cationic Blue SD-SL by the strain ZHT-3

2.4 不同因素對脫色率的影響

廢水中的pH值對生物處理十分重要，氫離子能影響細菌的生長和功能酶的活性，從而導致染料降解效果的不同。研究不同初始pH值對菌株ZHT-3脫色的影響曲線如圖5A所示。可以看出菌株ZHT-3對pH的適應范圍較寬，在pH 5～8范圍內24 h脫色率均在93.4%以上，其中在pH 為7時脫色率最高，可達98.4%，可能是由蠟狀芽胞桿菌生長的最適pH是中性條件決定的。當pH大于8或者小于5時，脫色率急劇下降。說明pH值過高或過低影響酶功能及其催化反應速率，嚴重抑制菌株的脫色。

不同溫度下菌株ZHT-3的脫色情況如圖5B所示。培養24 h后，該菌能夠在30～40 ℃范圍內保持較高的脫色率，表明菌體產生的偶氮還原酶在這一溫度范圍內均具有較高的酶活性。而當溫度超過40 ℃時脫色率急速降低至18.6%，其原因可能由于菌體蛋白質、核酸、酶等重要組成成分因溫度過高發生不同程度的破壞，影響菌株的脫色能力[16]。而當溫度低于30 ℃時菌株的脫色能力逐漸降低，25 ℃時脫色率為52.4%，可能是由于溫度過低抑制了菌體生長繁殖，降低酶活性，導致脫色率的下降。

轉速在150 r/min時，菌株ZHT-3對陽離子藍的脫色率最高，達98.5%。轉速在0～200 r/min范圍內，脫色率可保持在92.1%以上，可見振蕩轉速對菌株ZHT-3的脫色并沒有明顯影響(圖5C)。因此在實際應用中，可以選擇靜置脫色，降低成本。脫色后培養基內溶解氧含量較脫色前明顯減少，這說明菌株ZHT-3在降解陽離子藍時需要氧的參與。

圖5 不同pH(A)、溫度(B)和轉速(C)對脫色率的影響Fig.5 Influences of different pH(A)、temperature(B) and shaking speed(C) on decolorization rate

2.5 ZHT-3對陽離子藍的脫色途徑

從圖6可以看出，使用活菌ZHT-3對陽離子藍的脫色率明顯高于使用高壓蒸汽滅活后的菌株，前者的脫色率可達95%以上，而后者卻僅約13%。使用滅活后菌株進行脫色實驗后，反應液經離心回收的沉淀呈深藍色，而用未滅活菌株則無此現象。說明滅活后菌株僅通過吸附作用去除陽離子藍，其脫色效果十分有限。因此菌株ZHT-3對陽離子藍的生物降解在脫色過程中發揮了主要作用。

對比觀察脫色過程中試樣上清液的紫外-可見吸收光譜，可以發現脫色前的試樣在587 nm處有陽離子藍的特征吸收峰。隨著脫色反應的進行，該特征吸收峰的強度不斷減弱。脫色24 h后，則完全消失(圖7)。這表明陽離子藍的偶氮鍵發生斷裂，生色團消失。此外，該特征吸收峰在強度降低的過程中吸收波長發生紅移，這是由于偶氮共軛體系被破壞后，連接在偶氮鍵兩側的取代基發生了變化。

表2 不同陽離子染料脫色菌的脫色性能Table 2 ecolorization performance of different decolorizing bacteria for Cationic Dye

圖6 活菌與滅活菌對陽離子藍的脫色率Fig.6 Decolorization rate of Cationic Blue SD-GSL by live and dead strain ZHT-3

圖7 陽離子藍脫色過程中的吸收光譜Fig.7 Absorption spectrum during the decolorization process ofCationic Blue SD-GSL

3 討 論

目前，有關陽離子染料生物脫色研究主要針對的染料包括堿性藍41、甲基藍、陽離子翠藍X-GB等。表2列舉了現有脫色菌的種類及其脫色性能。盡管它們最佳脫色率都很高，但在對染料初始脫色濃度、達到最佳脫色率所需時間上存在明顯差別。

與以往報道的陽離子染料脫色菌相比，本研究分離得到的蠟狀芽胞桿菌ZHT-3不僅脫色率高，而且能夠適應陽離子染料更高的初始濃度，并能夠在更短的時間內達到最佳脫色率。這些特點意味著該菌在未來的實際應用方面具有突出的優勢。

值得注意的是，Telke等[21]以活性染料活性橙16為目標染料馴化得到波株芽胞桿菌ADR(Bacillussp.)，發現該菌株對陽離子染料堿性綠4也具有一定的脫色能力，對100 mg/L堿性綠4在60 h脫色率為94%，但并未鑒定出該芽胞桿菌的具體菌種。芽胞桿菌屬包括枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞菌、蠟狀芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌等，共計147種[22]。不同種類的芽胞桿菌特性差異很大，并非所有的芽胞桿菌都具有降解陽離子染料的能力。目前蠟狀芽胞桿菌在降解環境污染物中的研究較多，如四環素、有機磷農藥和芘污染物等[23-25]。但就作者所知，尚未見有關蠟狀芽胞桿菌對陽離子藍染料脫色的研究報道。

本研究篩選出的蠟狀芽胞桿菌ZHT-3能夠對陽離子藍快速脫色，在脫色12 h后對300 mg/L陽離子藍的脫色率達84.5%。隨后脫色率緩慢增加，直至在30 h達到最大脫色率98.8%。沈明等[26]提出，陽離子染料含有很復雜的芳香基團，其偶氮雙鍵還原為胺基而脫色產生的胺基類中間產物毒性比較大，對菌株生長有抑制作用，這可能是造成脫色后期脫色率增長緩慢的主要原因。

研究菌株ZHT-3降解特性時發現，對于500 mg/L以內的高濃度染料有非常好的脫色效果及耐受能力。隨著初始陽離子藍濃度的增加，對菌體生長的抑制作用更明顯，菌株的脫色速率逐漸有所降低，雖然高濃度的脫色速率比低濃度的脫色速率低，但到后期脫色穩定后基本持平。如若對菌株在高濃度下進行長期馴化，很可能繼續提高菌株的耐受能力及脫色性能，更有利于其作為工程菌使用，為降解陽離子染料廢水高濃度有機污染物提供有用的菌源。陽離子染料廢水pH低，菌株ZHT-3在pH 5～8，30～40 ℃范圍內都有良好的脫色性能。Kale等[12]利用堿性藍41篩選出的假單胞菌AAB3在pH 6～ 7，37 ℃時脫色率達到80%。李玲玉等[15]篩選出的棒桿菌51#在pH為 7，30 ℃下脫色率最高為61.6%，對脫色條件要求嚴格。與上述菌株相比，ZHT-3對環境的適應能力更好。同時ZHT-3在靜置或振蕩條件下脫色率均在92.1%以上。彌補了以往菌株脫色所需時間較長、脫色條件單一、脫色濃度過低等方面的局限。

關于連續脫色對微生物脫色性能的影響研究很少。在實際廢水處理中，隨著脫色反應的進行，由于源源不斷的污染物負荷以及有毒物質產生等均會導致微生物脫色性能的下降，使得微生物在染料廢水生物處理中存在很大的局限性。本研究中菌株ZHT-3 連續脫色2次后的脫色率由85.8%上升至95.4%，這是由于菌株ZHT-3無法以染料作為唯一碳源并加以利用，只能通過外加碳源為菌體生長提供所需能量和電子供體，從而合成偶氮還原酶使染料降解脫色。在初次脫色時碳源充足，其代謝調控被碳源所抑制，降低合成偶氮還原酶的能力，而第二次脫色時碳源處于低水平濃度，在該條件下更有利于酶的合成，促進菌株的脫色[27]。菌株ZHT-3連續脫色3次其脫色率仍保持在79.2%，而王震文[16]通過紫外誘變得到的菌株YZU1每隔24 h 接入100 mg/L的活性黑5進行連續脫色2次后，脫色率已降至58%。尹亮[28]利用混合菌群共培養對100 mg/L的直接藍289連續脫色3次脫色率為76.4%。由此可見，菌株ZHT-3的連續持久脫色能力明顯優于已報道的單一菌株和混合菌群，培養條件相對簡單，有利于工業應用。

菌株ZHT-3主要通過生物降解作用實現對陽離子藍的脫色，能夠使陽離子藍的偶氮鍵斷裂，從而破壞陽離子藍的生色團，達到脫色效果。有關陽離子藍脫色產物的結構及毒性、降解機制有待進一步研究，以期為染料廢水處理提供科學參考。