丙泊酚對臍帶間充質干細胞移植治療大鼠脊髓損傷后肢功能變化的影響

周亞凈 劉建敏 魏淑明 張云豪 曲振華 陳樹波

(河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院麻醉科，河北 邢臺 054001)

隨著工業化程度的發展愈發迅速，人們脊髓損傷的臨床發病率也呈現出上升的趨勢，而脊髓損傷的預后一般較差，且具有很高的致殘率。臨床工作的難點在于如何最大程度修復脊髓損傷，以達到肢體功能康復的目的，提升患者的生存質量及生存率，減少死亡率〔1～3〕。丙泊酚臨床應用多為全身麻醉的誘導和維持，但經過已進行的研究表明，其對神經系統的損傷也能起到一定保護作用〔4～6〕。臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)作為干細胞中應用前景廣泛的一類，經過一定條件的誘導，分化為不同的組織細胞，也有一定概率分化為神經元細胞，為治療脊髓損傷展示了新的思路〔7～10〕。因此本研究將單獨移植人UC-MSCs、單獨應用丙泊酚及聯合使用UC-MSCs和丙泊酚應用于脊髓損傷模型的治療，觀察其對脊髓損傷的作用及對肢體功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑 在濰坊醫學院附屬益都中心醫院其足月妊娠剖宮產健康胎兒的臍帶，70只成年雌性，體重200～250 g健康的SD大鼠〔許可證號SCXK(冀)20080010〕，購自河北省實驗動物中心；L-DMEM培養基為美國GibcoBRL公司產品；從美國ThermoForma公司購買細胞培養箱，上海信然生物技術有限公司)提供的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，粉劑，pH7.2)；依地酸二鈉鈣(EDTA，天津市化學試劑一廠)；胰蛋白酶(GibcoBRL公司)；胎牛血清(FBS)(Hyclone公司產品)。CM-Dil、谷氨酞胺(美國Sigma公司)；從美國SantaCruz公司購買的辣根過氧化物酶(HRP)。

1.2UC-MSCs的培養及鑒定 經過倫理委員會的批準，本實驗收集足月剖腹產胎兒的臍帶組織若干，去除血管后，0.1%Ⅱ型膠原酶，剩余的間質組織切割成大約直徑為1 mm3組織塊，將處理好的組織塊收集，胰酶(0.25%濃度)以2倍體積被加入予以充分消化30 min。離心后留存下來的細胞及組織，被接種于直徑10 cm的培養皿中，加入DMEM培養基及5% FBS進行培養。首次傳代后每3天按1∶3的比例傳代，實行擴增培養。提取P3代細胞，消化后加人相應對照標記及PEFITC標記的CD73、CD105、CD31、KDR、CD34、VWF、CD45、HLA-DR、CD235a流式抗體，經流式細胞儀檢測。

1.3CM-Dil標記UC-MSCs 提前將CM-Dil液用專用的稀釋劑稀釋，然后在1 ml DMEM培養基(含有5% FBS)中加入稀釋過的CM-Dil液5 μl，此操作過程需要完全避光。將混合后的標記液加入上述UC-MSCs的培養皿中，濃度為40 μl/cm2，加入標記液后的UC-MSCs細胞(融合度達到80%以上)繼續被放入恒溫37℃培養樣孵育20 min。標記過程結束后，將標記液吸出丟棄，用PBS清洗3次，加入完全培養基(DMEM 9.5 ml+0.5 ml FBS)清洗3次，再繼續用上述完全培養基培養24 h。熒光顯微鏡被應用于觀察UC-MSCs被CM-Dil標記的情況，吸取適量傳代時制成的UC-MSCs單細胞懸液用以加入流式細胞儀，通過對細胞懸液的檢測得出CM-Dil的標記率。

1.4動物模型的建立及分組 在正式實驗前將所有SD大鼠制成脊髓損傷模型。所有大鼠從購買來后在實驗室適應性飼養14 d，全部稱重后將其麻醉，麻醉藥物選用10%水合氯醛溶液，麻醉濃度為350 mg/kg，將大鼠以俯臥位固定四肢于操作臺上，麻醉方式為腹腔注射給藥。大鼠背部被完整備皮后，沿著脊柱逐層切開背部皮膚，完全暴露出T7～T10，硬膜保持完整的前提下去除部分T8～T9的棘突和椎板。接下來將10 g重物從2.5 cm高處落下砸擊大鼠暴露出來的硬膜及脊髓組織(改良Allen法)〔11，12〕。縫合后待大鼠恢復意識后繼續放回籠中飼養，造模成功的標志是大鼠出現雙下肢癱瘓，相應運動功能評分為0，并伴隨有尾巴痙攣擺動。造模成功64只SD大鼠，死亡6只，成功造模的SD大鼠被隨機分為對照組、UC-MSCs組、丙泊酚組、聯合組各16只。造模6 d后，對照組注射1 ml純DMEM培養基，UC-MSCs移植組注射1 ml UC-MSCs細胞懸液(細胞數3×106個/L)，丙泊酚組利用尾部留置針連續4 h注射丙泊酚溶液(2 ml·kg-1·h-1)，聯合組的處理是在注射與UC-MSCs移植組相同劑量的細胞懸液后與丙泊酚組一起通過尾部留置針連續注射預制好的丙泊酚溶液(2 ml·kg-1·h-1)。

1.5下肢運動功能評價 應用斜板試驗、Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分〔13～16〕，造模前1 d及造模后1、3 d、1、2、3、4 w，一共測評6次，每次評價均從上午8：00開始，由兩人合評后取平均分。

1.6HE及熒光顯微鏡觀察 隨機從每組中選取5只造模4 w的脊髓損傷模型大鼠，麻醉方式與上述一致，然后暴露出所選擇出的所有模型SD大鼠脊髓損傷的部位，約1 cm脊髓損傷區域的組織被分別取出，加入提前預制好4%的甲醛予以充分固定，固定好后將其用石蠟包埋并制作成切片，分別被用于HE染色和免疫組織化學。將切片進行二甲苯脫蠟處理，然后予以從高到低的乙醇水合，2 min的水洗后再加以蘇木素予以充分染色5 min，再次水洗后加入鹽酸乙醇分化，弱氨水反藍后水洗再將伊紅染液應用于切片染色15 min。再次通過梯度乙醇溶液脫水處理，加入二甲苯使其透明，封片時采用中性樹脂。光學顯微鏡被應用于脊髓損傷的情況，CM-Dil標記的陽性細胞數則是使用熒光顯微鏡觀察。

1.7體感誘發電位(SEP)和運動誘發電位(MEP)的檢測 再次隨機從各組抽出5只模型大鼠，分別于造模后及傷后4 w予以10%水合氯醛將其麻醉后固定四肢，檢測其MEP和SEP〔17〕。SEP將電極放于頭皮下后肢皮層感覺區后方約0.5 cm處，給予電流刺激(直流方波)，頻率為3 Hz，波寬為0.2 ms，強度為5～15 mA疊加次數為50～60次。MEP：將電極放置于大腦皮質運動區，強度為40 mA，波寬為0.1 ms，頻率為1 Hz，掃描速度為5 ms/D，疊加次數為300～500次，靈敏度為5 μV/D。對電流刺激后的幅度和相應誘發電位潛伏期被詳細記錄。

1.8HRP逆行神經示蹤 隨機從各組抽出5只模型大鼠，麻醉后部分暴露脊椎，注射用生理鹽水溶解HRP。采用留置針進針，溶解后的HRP溶液以0.1 μl/10 min的速度注射，注射1 μl HRP完畢后，繼續留針15 min再拔針。做好相應標記，繼續將本次抽選的所有SD大鼠放回籠中飼養3 d。3 d后將注射過HRP的大鼠取出麻醉后留取脊髓組織予以冰凍切片，再應用二氨基聯苯胺(DAB)加強染色法。每組隨機抽取10張切片，對切片上HRP陽性神經纖維束進行計數。

1.9統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1UC-MSCs形態學觀察 UC-MSCs接種到培養皿并加入含有5% FBS的培養基第4天，細胞貼壁數顯著增多，貼壁在皿底的細胞形態大部分呈現出單一的長梭形，部分形成集落。培養至第9天時，培養皿底部細胞融合度達到90%以上，出現旋渦狀細胞集落。流式細胞儀被應用于UC-MSCs細胞標記率的檢測，結果顯示CD90(90.7%)，CD49(84.9%)，CD29(99.4%)，CD105(92.2%)陽性，被CM-Dil標記后的細胞標記率達100%。熒光顯微鏡觀察下培養皿中的UC-MSCs，鏡下可見標記后的UC-MSCs呈現出紅色熒光，見圖1。

2.2下肢運動功能評價結果 造模前4組SD大鼠的斜板試驗、BBB評分差異無統計學意義(P>0.05)，造模后2～4 w，與對照組比較，丙泊酚組、UC-MSCs組及聯合組的評分均更高，其中聯合組分數最高(P<0.05)，見表1。

2.3HE染色和熒光顯微鏡觀察 通過對HE染色后的大鼠脊髓組織切片進行觀察，對照組可見明顯的脊髓損傷空洞，而其他組脊髓空洞明顯減小，其中聯合組空洞面積最小，見圖2。通過熒光顯微鏡觀察注射經CM-Dil標記后的UC-MSCs組脊髓切片，可見散在紅色熒光，且聯合組被熒光標記細胞數更多，見圖3。

圖1 第3代UC-MSCs形態學觀察(×200)

表1 各時間點BBB評分、斜板試驗、改良Tarlov評分

與同時點對照組比較：1)P<0.05

對照組

丙泊酚組

UC-MSCs組

聯合組

對照組

丙泊酚組

UC-MSCs組

聯合組

2.4SEP和MEP的檢測結果 脊髓損傷模型建立后，治療各組大鼠SEP、MEP均未被檢測到，傷后4 w，MEP、SEP均有不同程度恢復(P<0.05,P<0.01)，對照組輕微恢復電位，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表2，表3。

表2 傷后4 w各組SEP檢測

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.5HRP逆行神經示蹤 HRP注射后經逆行運輸，觀察4組脊髓損傷模型大鼠的脊髓切片可見T8以上節段有被HRP標記的神經纖維。見圖4。對照組可見少量的神經纖維(14.24±3.51)個/高倍視野，另外經過治療的三組神經纖維數目都較之明顯升高，盡管丙泊酚組及UC-MSCs組〔(21.52±4.40，20.38±3.84)個/高倍視野〕比對照組明顯增高，但對比聯合組明顯減低〔(31.21±5.40)個/高倍視野，P<0.01〕。

表3 傷后4 w各組MEP檢測

對照組

UC-MSCs組

聯合組

丙泊酚組

3 討 論

脊髓損傷的發病率上升趨勢越發明顯，其原因與社會工業化程度的日益加深及經濟高速發展有著密切的聯系〔18，19〕。脊髓一旦發生損害，患者的生活質量及疾病預后都十分不樂觀，因其損傷后的脊髓不能自我修復、再生，從而隨著損傷后繼發的一系列神經系統病理變化，可能會對病人造成永久性的神經損傷，導致極高的致殘率及死亡率。急性脊髓損傷所導致的一過性損傷，大量的自由基在損傷區域產生，介導之后的一系列氧化反應，同時自由基、細胞因子等觸發細胞凋亡，引起很多繼發性的病理變化，導致損傷區域的神經系統功能缺失〔16，20～23〕。

臨床上現有的針對脊髓損傷的治療方法，多是通過對營養神經藥物的應用，從而維持脊髓神經系統的現有功能，同時配合一定的肢體康健治療，促進瀕臨壞死的神經元的功能恢復〔24，25〕。但是，脊髓神經細胞本身已經不具有自我修復及再生的功能，現有的常用治療手段只能使肢體功能部分恢復，不能達到損傷前水平，甚至導致肢體致殘后，不僅影響患者生活質量，更對患者心理有不良作用。如何使脊髓神經細胞在體外誘導分化成為遺傳穩定的組織細胞干細胞是研究者關注中心〔26，27〕。UC-MSCs是一類存在于新生兒臍帶組織中的干細胞，是其他細胞的“種子”，具有強大的分化能力，并且也有一定的遷移能力，可以成為骨髓神經元的良好供體。UC-MSCs移植進脊髓損傷的機體后，通過釋放趨化因子遷移進入損傷區域，分化成為所需要補充的細胞，同時降低炎性反應，從而使得脊髓組織重構，恢復神經系統功能〔28，29〕。

本文結果顯示，丙泊酚對損傷的脊髓神經組織具有保護作用，丙泊酚聯合UC-MSCs移植治療脊髓大鼠損傷，使得神經元再生，對下肢的神經生理功能有著極大的改善，運動功能恢復良好，有助于日后臨床工作中成為治療方法的另一種選擇。

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