不同劑量右美托咪定對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織TNF-α、IL-1β及ICAM-1表達(dá)的影響

方 潔

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450000)

腦部對(duì)缺血缺氧敏感性高，缺血后再灌注導(dǎo)致腦部出現(xiàn)嚴(yán)重的不可逆損傷，同時(shí)多種高危風(fēng)險(xiǎn)手術(shù)潛在發(fā)生腦缺血的風(fēng)險(xiǎn)，腦部病變位置易發(fā)生炎癥、神經(jīng)元變性和氧化應(yīng)激等，這是導(dǎo)致患者死亡的重要原因〔1〕。目前臨床上常采用再灌注療法，通過(guò)血液再灌注使腦組織的缺血缺氧部位代謝恢復(fù)正常，同時(shí)加速代謝產(chǎn)物的清除速度，但是治療窗窄，僅有一小部分患者適用此法〔2〕。近幾年研究發(fā)現(xiàn)〔3，4〕，右美托咪定(DEX)對(duì)于腦缺血再灌注損傷的腦組織具有保護(hù)作用，不僅能夠降低兒茶酚胺的生成量，而且能夠下調(diào)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放量。臨床上對(duì)于DEX治療腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制研究較多，但是具體的用藥劑量及是否存在劑量依賴(lài)性尚未明確。本研究通過(guò)不同劑量的DEX干預(yù)腦缺血再灌注大鼠血清及腦組織中相關(guān)因子水平變化。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)健康SD大鼠60只，雌雄各半，周齡7～10 w，體重220～250 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于潔凈級(jí)環(huán)境中，自由飲食，飼養(yǎng)室溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度55%～60%，換氣8～12次/h，保持光線每隔12 h交替，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。按照隨機(jī)數(shù)字表法。將大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、低劑量DEX組、中劑量DEX組和高劑量DEX組，每組12只。

1.2造模及給藥方法 造模方法參考Longa等〔5〕記載的大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注模型。試驗(yàn)前用3.6%水合氯醛腹腔注射10 ml/kg進(jìn)行麻醉，將大鼠仰臥位固定四肢，切開(kāi)頸部右側(cè)正中皮膚，做一2～3 cm的切口，使得右側(cè)頸總動(dòng)脈充分暴露，鈍性分離頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈至分叉處，并用眼科剪子細(xì)分離周邊組織，同時(shí)避免損傷迷走神經(jīng)和氣管，使用3號(hào)線結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈處用2 ml注射器扎一小孔，使用3-0尼龍線從小孔插入頸內(nèi)動(dòng)脈約18 mm，輕微感到阻力后，將頸內(nèi)靜脈結(jié)扎并固定尼龍線，在頸中動(dòng)脈外置留0.5 cm尼龍線，從而阻斷右大腦中動(dòng)脈入口，使得大腦右側(cè)中動(dòng)脈供血區(qū)形成缺血區(qū)域，阻斷2 h后拔出線栓進(jìn)行再灌注，逐層縫合皮下組織和皮膚，腦缺血再灌注模型造模完畢。造模成功的標(biāo)志為阻斷血流成功1 min后，大鼠瞳孔擴(kuò)大，顏色蒼白，呼吸速度加快，恢復(fù)血流灌注后，瞳孔顏色恢復(fù)為鮮紅色。Sham組大鼠只進(jìn)行分離血管，并不插線栓，術(shù)中持續(xù)靜脈泵入生理鹽水2 h，速度2 ml/h；I/R組大鼠造模完畢后持續(xù)靜脈泵入生理鹽水2 h，速度2 ml/h；DEX組中DEX均使用生理鹽水稀釋?zhuān)蛣┝緿EX組大鼠造模完畢后，首次靜脈輸注6 μg/kg DEX，10 min內(nèi)完成，同時(shí)剩余的DEX以0.05 μg·kg-1· min-1速度持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度為2 ml/h；中劑量DEX組大鼠造模完畢后，首次靜脈輸注60 μg/kg DEX，10 min內(nèi)完成，同時(shí)剩余的DEX以0.5 μg·kg-1· min-1速度持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度為2 ml/h；高劑量DEX組大鼠造模完畢后，首次靜脈輸注600 μg/kg DEX，10 min內(nèi)完成，同時(shí)剩余的DEX以5.00 μg·kg-1· min-1速度持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度為2 ml/h。

1.3觀察指標(biāo) 造模結(jié)束后，評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度。各組大鼠在腦缺血再灌注24 h后進(jìn)行麻醉，從右心室采血3 ml，置于未涂肝素鈉的離心管中，立即離心，3 500 r/min離心10 min，取上清液，置于-20℃冰箱中待測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β及細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1的表達(dá)水平，試劑盒由美國(guó)R&D公司提供，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。另外，麻醉后斷頭去腦，置于-80℃冰箱中，除去小腦及腦干等位置，剩余部分采用冠狀位切片，從額極向后切片，厚度為2 μm，應(yīng)用雙氧水處理10 min，然后使用非免疫血清封閉15 min，加入兔抗鼠一抗(購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)，在室溫下過(guò)夜反應(yīng)，接著使用PBS洗脫，避光條件下，采用DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行顯色，使用光鏡觀察。放大200倍，應(yīng)用MAS2圖像分析系統(tǒng)對(duì)腦組織中TNF-α、IL-1β及ICAM-1在單位視野中表達(dá)陽(yáng)性的積分光密度。另外將部分腦片置于2% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37℃避光孵育30 min，孵化結(jié)束后照相，使用AutoCAD軟件計(jì)算染色結(jié)果，統(tǒng)計(jì)梗死區(qū)域面積。

1.4神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔6〕在大鼠清醒后，對(duì)神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評(píng)估，共分為五個(gè)等級(jí)：0分，神經(jīng)功能無(wú)缺損；1分，左前爪不能伸直；2分，行動(dòng)過(guò)程中向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行動(dòng)過(guò)程中身體向左側(cè)傾斜；4分，自主行動(dòng)能力和意識(shí)喪失。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能評(píng)分和梗死區(qū)域面積比較 造模大鼠均出現(xiàn)了一定程度的神經(jīng)功能缺損和梗死面積。與Sham組相比，其他各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及梗死面積均明顯更高，同時(shí)高、中、低劑量DEX組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及梗死面積均顯著低于I/R組(P<0.05)，不同劑量DEX組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及梗死面積之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分和梗死區(qū)域面積比較

與Sham組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05，下表同

2.2各組血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表達(dá)水平比較 與Sham組相比，其他各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與I/R組相比，高、中、低劑量DEX組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，不同劑量DEX組大鼠血清中各檢測(cè)指標(biāo)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組腦組織中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表達(dá)水平比較 其他各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表達(dá)水平均明顯高于Sham組，同時(shí)高、中、低劑量DEX組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表達(dá)水平顯均著低于I/R組(P<0.05)，但是不同劑量DEX組大鼠血清中各檢測(cè)指標(biāo)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表達(dá)水平對(duì)比

表3 各組腦組織中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表達(dá)水平比較

3 討 論

臨床腦缺血再灌注損傷患者發(fā)生危急癥狀時(shí)，即使得到有效的治療后，患者依然存在意識(shí)障礙，可導(dǎo)致患者心肺衰竭，甚至成為植物人，這些均是由腦缺血再灌注損傷所致。腦缺血再灌注損傷作為一個(gè)十分復(fù)雜的病理過(guò)程，其中多種因素參與其中，包括炎癥反應(yīng)、興奮性神經(jīng)毒性、自由基損傷、Ca2+超載及膜脂質(zhì)過(guò)氧化等，其中炎癥反應(yīng)是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因〔7〕。炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)抗外界危險(xiǎn)因素和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制，同時(shí)又可能導(dǎo)致機(jī)體損傷，血腦屏障通透性增加后，大量的炎性因子通過(guò)血腦屏障加重腦缺血程度〔8〕。另外有研究證實(shí)，患者一旦出現(xiàn)腦缺血，體內(nèi)的炎性反應(yīng)能夠?qū)е履X組織發(fā)生繼發(fā)性損傷，在此基礎(chǔ)上，多種因素的相互作用，誘發(fā)缺血再灌注損傷〔9〕。本研究說(shuō)明腦缺血再灌注大鼠血清和腦組織中炎性反應(yīng)增強(qiáng)，TNF-α作為重要的炎性因子，具有多種生物活性物質(zhì)，如炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)，機(jī)體在正常狀態(tài)時(shí)，TNF-α具有抗感染和加速組織修復(fù)的功能，但是機(jī)體處理病理狀態(tài)時(shí)會(huì)促進(jìn)組織損傷，TNF-α能夠上調(diào)一氧化氮合酶的表達(dá)量，從而產(chǎn)生大量的一氧化氮，促進(jìn)氧自由基生成，同時(shí)還能促進(jìn)興奮性氨基酸的釋放，另外能破壞血腦屏障，加速炎性因子進(jìn)入血液中，導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷〔10〕。IL-1β是觸發(fā)炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)之一，能夠通過(guò)促進(jìn)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而且還可以協(xié)同細(xì)胞因子激活淋巴細(xì)胞，另外能誘導(dǎo)其他炎性因子的釋放，最終致使神經(jīng)元損傷〔11〕。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族成員之一，主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面，機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，ICAM-1表達(dá)水平低，但是血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷后，分泌大量的ICAM-1，其能夠加速中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞聚集，并釋放氧自由基〔12〕。DEX作為這一種高選擇性α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，對(duì)α2受體的敏感性是α1的1 620倍，同時(shí)也是可樂(lè)定的8倍，半衰期比可樂(lè)定短，藥代動(dòng)力學(xué)的預(yù)測(cè)性強(qiáng)于可樂(lè)定，2009年我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床麻醉誘導(dǎo)、鎮(zhèn)靜及抗焦慮等，廣泛應(yīng)用于臨床，但是并未對(duì)DEX的具體用量進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)定。本研究提示DEX能夠有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠血清及腦組織中的相關(guān)指標(biāo)。DEX發(fā)揮藥理作用主要有以下三個(gè)機(jī)制：①抑制中樞交感神經(jīng)活性，提高腦部供血量和供氧量，改善腦部缺血區(qū)域血流灌注狀態(tài)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的功能；②升高血管內(nèi)Ca2+濃度，降低谷氨酸水平，避免神經(jīng)中毒；③降低兒茶酚胺的釋放量，降低炎癥損傷程度，保護(hù)神經(jīng)元。本研究結(jié)果提示不同劑量的DEX治療腦缺血再灌注損傷并無(wú)顯著的劑量關(guān)系，臨床上可以選擇較低的劑量進(jìn)行治療，從而降低藥物不良反應(yīng)。

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