circRNA、microRNA與低氧性肺動脈高壓的相關性研究進展

夏世金 王 堅 邰先桃 王厚融

(復旦大學附屬華東醫院上海市老年醫學研究所，上海 200040)

低氧性肺動脈高壓(HPH)是對人的健康危害極嚴重、治療難度極大、致死率和致殘率極高的病理生理綜合征，故有“假惡性”腫瘤之稱〔1〕。HPH發生機制一直是醫學研究的熱點和難點〔2〕。中國40歲以上人群中COPD患病率高達8.2%，大多數COPD患者(尤其是老年患者)最終由HPH發展為肺心病〔3〕。HPH是COPD發展到肺心病的中心環節。深入研究并闡明HPH發生發展機制，對有效防治HPH和預防COPD進展為肺心病具有重大意義。

1 microRNA與HPH

低氧性肺血管結構重建(HPVSR)是HPH形成的基本病理生理特征之一〔4〕，低氧可致肺動脈平滑肌細胞(PASMC)由收縮型向合成型轉化、PASMC異常增殖加速和凋亡減慢、肺血管阻力增加和肺動脈壓升高。PASMC異常增殖加速和凋亡減緩在HPVSR中起著關鍵作用。治療HPH策略已從單純舒張血管平滑肌降低肺動脈壓力轉變到抑制血管異常增生和肺血管結構重建。闡明低氧性PASMC異常增殖與凋亡在HPVSR中的作用與機制，對尋求有效防治HPH新策略意義重大。雖然從經典遺傳學角度探索HPH機制已經取得可喜進展，但HPH的機制依然未完全闡明，HPH的有效防治依然未徹底解決，遭遇困境。然而，近年生機勃勃的表觀遺傳學將為闡明HPH機制帶來新希望。表觀遺傳調控幾乎存在于生物調控所有環節〔5〕。即使去除干預因素，表觀遺傳修飾也可長時間保持穩定并維持調控基因的表達水平。所以，表觀遺傳學在闡明疾病發生機制方面展示其獨特優勢和巨大潛力。

當前表觀遺傳學中研究非?；钴S的一個重要調控機制是microRNA(miRNA)。miRNA是一類高度保守的非編碼RNA(ncRNA)。miRNA選擇性結合到RNA誘導的沉默復合體上，并通過堿基互補配對與靶mRNA 3′非翻譯區(3′-UTR)特異序列結合，抑制mRNA翻譯或將其降解，負性調控靶基因的表達〔6，7〕。miRNA在HPH的形成中發揮著重要作用。在HPH模型大鼠肺中miR-451等表達上調和miR-22等表達下調〔8〕。miR-145/-143是平滑肌細胞高表達的一組miRNA，被稱為血管平滑肌細胞標志物，是促進平滑肌細胞分化和穩定表型的重要分子開關〔9〕。miR-21在低氧刺激的人PASMC中表達上調，通過抑制PDCD4等多個靶基因促進細胞增殖與遷移〔10〕。在HPH患者血液中miR-23b等表達顯著上調，miR-1等表達明顯下調〔11〕。然而，用miRNA研究策略試圖闡明HPH發生機制依然困難重重?？上驳氖?，最近越來越備受關注的、miRNA的內源性競爭RNA(ceRNA)——環狀RNA(circRNA)為明確HPH發生發展機制、闡明早期干預靶點及診斷生物學標志物提供新方法和新策略〔12〕。

2 circRNA與HPH

circRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，是RNA家族的新成員和研究最新熱點。近年國際頂級刊物Nature發表了有關circRNA生物學功能的論文〔13，14〕，使得研究者對circRNA高度關注，掀起研究熱潮。

circRNA由特殊可變剪接產生，存在于真核細胞胞質，呈現組織、時序和疾病的特異性。circRNA分子由于是封閉的環狀結構，所以不受RNA外切酶的影響，表達更加穩定，而且不易降解。circRNA在機體組織細胞和血液中表達〔12〕。circRNA與疾病關聯的miRNA發生相互作用，調控疾病的發生，為闡明疾病發生機制、確立診斷標志物和干預靶點提供強有力的手段。circRNA目前最具共識的是通過吸附miRNA(即miRNA sponge，miRNA海綿)機制發揮其功能〔12〕(見圖1)。由于circRNA分子富含miRNA應答元件，可通過與miRNA發生海綿作用，進而削弱miRNA對其下游靶基因的抑制效果，上調下游靶基因的表達〔14〕。研究發現，circRNA CDR1as具有至少60個miR-7結合位點，充當miR-7的海綿，可影響miR-7的靶基因活性〔14〕。在發育的中腦中CDR1as和miR-7有共同高表達的特征。在斑馬魚胚胎中，CDR1as過表達造成中腦體積變小，而通過注射miR-7前體后中腦體積得以部分恢復，表明CDR1as的生物學功能至少部分是通過CDR1as與miR-7的相互作用而產生〔14〕。CDR1as是miR-7的環狀抑制劑，負性調控miR-7，從而影響腫瘤的發生〔14〕，發揮天然miRNA海綿功能〔15〕。CDR1as可能與帕金森病的發生相關〔16〕。當ciRS-7(也被稱為CDR1as)的海綿功能缺失時，miR-7表達上調，極有可能下調阿爾茨海默病相關蛋白(如泛素化蛋白連接酶A)的表達〔17～19〕。睪丸特異性基因Sry 的circRNA具有16個miR-138的靶位點，充當miR-138海綿〔14〕。circRNA cANRIL是基因INK4/ARF的反義轉錄物〔20〕，可通過差異的PcG募集來抑制INK4/ARF表達，進而參與調控動脈粥樣硬化的發生〔21〕。

(A)circRNA作為miRNA的環狀抑制劑，充當miRNA海綿；(B)circRNA與蛋白結合；(C)circRNA與其他RNA通過堿基互補配對結合圖1 circRNA的主要功能示意圖〔12〕

作者前期研究發現〔22〕：(1) 芯片篩選實驗：對HPH模型小鼠肺組織進行circRNA芯片篩選，結果發現：HPH模型組(與常氧組比較)小鼠肺組織中circRNAs表達顯著上調有23個，顯著下調有41個。(2)RT-PCR肺組織驗證實驗：接著挑選芯片篩選出的差異表達circRNAs中上調或下調倍數相差較大的12個circRNAs(上調或下調各6個)進行RT-PCR驗證，結果發現：HPH模型組小鼠肺組織中circRNAs表達顯著上調(與芯片結果完全一致)有5個(mmu_circ_0000410、mmu_circ_0001209、mmu_circ_0000173、mmu_circ_0001898、mmu_circ_0000007)，顯著下調(與芯片結果完全一致)有2個(mmu_circ_0001033、mmu_circ_0001724)(根據circBase數據庫circRNA ID命名)。這項創新性的研究結果預示著circRNA之矛將有可能戳穿HPH發生機制之盾。作者的新近研究發現：(1)RT-PCR細胞驗證實驗：基于上述芯片結果，以常氧(對照)和低氧性的小鼠PASMC標本為檢測對象，對上述相同的12個差異表達的circRNAs再次進行RT-PCR驗證，結果表明，低氧性PASMC中circRNAs表達顯著上調有3個(mmu_circ_0000410、mmu_circ_0000173、mmu_circ_0000007)、顯著下調也有3個(mmu_circ_0001033、mmu_circ_0001724、mmu_circ_0000543)，與芯片檢測和肺組織RT-PCR驗證的高度一致。(2)circRNA過表達慢病毒構建與轉染小鼠PASMC實驗：成功構建了mmu_circ_0001033過表達慢病毒載體，并且成功高效轉染入小鼠PASMC，運用CCK-8法檢測PASMC增殖，結果發現過表達的mmu_circ_0001033 可顯著抑制低氧所誘導的PASMC異常增殖。(3)circRNA、miRNA和mRNA三者之間關系研究：利用生物信息學技術和HPH相關miRNAs文獻整合分析發現，能夠與mmu_circ_0001033和mmu_circ_0000410結合的miRNAs有5條，預測這5條miRNAs的結合力最強的靶基因有30個，構建了circRNA-miRNA-mRNA三者之間關系網絡圖。基于上述實驗結果，結合circRNAs預測吸附的與HPH高度相關的miRNAs，綜合分析，從上述差異表達的circRNAs中，作者最終精選出mmu_circ_0001033和mmu_circ_0000410作為重點研究對象。

整合上述研究積累、HPH研究進展與作者前期相關研究的結果，凝煉出關鍵科學問題：circRNA是否參與HPH的發生？circRNA調節HPH的機制是什么？circRNA所吸附的miRNA的下游與HPH發生相關的靶基因有哪些？進而提出假設：(1)circRNA可調節HPH的發生；(2)circRNA可通過miRNA海綿(吸附miRNA)，以降低miRNA對其下游靶基因mRNA和蛋白表達的調控，發揮circRNA調節HPH的作用機制(見圖2)。為驗證上述假設，進而解決關鍵科學問題，擬制定的研究內容：(1)建立HPH小鼠和低氧性PASMC模型，構建circRNA的shRNA或過表達慢病毒載體，從而下調或上調目的circRNAs表達，觀察慢病毒轉染后小鼠HPH特征及細胞增殖與凋亡等變化，明確circRNA調節HPH的生物學功能；(2)運用RIP-PCR等方法明確circRNA與miRNA的結合關系，以及觀察circRNA/miRNA內源性競爭影響miRNA下游靶基因的表達變化與信號通路調控，明確circRNA、miRNA和mRNA三者的關系，探明circRNA的miRNA海綿機制；(3) 利用熒光素酶報告基因實驗等探索circRNA、miRNA和mRNA之間的直接結合情況，深度闡明circRNA調節HPH的分子機制；(4)運用HPH患者的血標本驗證目的circRNAs，確定HPH生物標志物。為闡明HPH的機制、確定臨床診斷生物標志物和干預靶點提供依據。

圖2 circRNA通過miRNA海綿調節miRNA下游靶基因表達從而調節HPH假設圖

總之，circRNA、microRNA與HPH三者之間具有密切的聯系，深入闡明circRNA和microRNA在HPH發生發展中的作用，為明確HPH發生發展機制提供新策略和新方法。

1McLaughlin VV，Archer SL，Badesch DB，etal.ACCF/AHA 2009 expert consensus document on pulmonary hypertension a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on Expert Consensus Documents and the American Heart Association developed in collaboration with the American College of Chest Physicians；American Thoracic Society，Inc.；and the Pulmonary Hypertension Association〔J〕.J Am Coll Cardiol，2009；53(17)：1573-619.

2Stenmark KR，Fagan KA，Frid MG.Hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling：cellular and molecular mechanisms〔J〕.Circ Res，2006；99(7)：675-91.

3Zhong N，Wang C，Yao W，etal.Prevalence of chronic obstructive pulmo-nary disease in China：a large，population-based survey〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007；176(8)：753-60.

4Xia S，Tai X，Wang Y，etal.Involvement of Gax gene in hypoxia-induced pulmonary hypertension，proliferation，and apoptosis of arterial smooth muscle cells〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2011；44(1)：66-73.

5Zhao S，Xu W，Jiang W，etal.Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation〔J〕.Science，2010；327(5968)：1000-4.

6Liu X，Park JK，Jiang F，etal.Dicer-1，but not Loquacious，is critical for assembly of miRNA-induced silencing complexes〔J〕.RNA，2007；13(12)：2324-9.

7Huntzinger E，Izaurralde E.Gene silencing by microRNAs：contributions of translational repression and mRNA decay〔J〕.Nat Rev Genet，2011；12(2)：99-110.

8Caruso P，MacLean MR，Khanin R，etal.Dynamic changes in lung microRNA profiles during the development of pulmonary hypertension due to chronic hypoxia and monocrotaline〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010；30(4)：716-23.

9Cordes KR，Sheehy NT，White MP，etal.miR-145 and miR-143 regulate smooth muscle cell fate and plasticity〔J〕.Nature，2009；460(7256)：705-10.

10Sarkar J，Gou D，Turaka P，etal.MicroRNA-21 plays a role in hypoxia-mediated pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and migration〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2010；299 (6)：861-71.

11Wei C，Henderson H，Spradley C，etal.Circulating miRNAs as potential marker for pulmonary hypertension〔J〕.PLoS One，2013；8(5)：e64396.

12夏世金，高 文，胡明冬，等.環狀RNA的研究現狀及展望〔J〕.中華肺部疾病雜志(電子版)，2014；7(6)：55-8.

13Memczak S，Jens M，Elefsinioti A，etal.Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency〔J〕.Nature，2013；495(7441)：333-8.

14Hansen TB，Jensen TI，Clausen BH，etal.Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges〔J〕.Nature，2013；495(7441)：384-8.

15Hentze MW，Preiss T.Circular RNAs：splicing′s enigma variations〔J〕.EMBO J，2013；32(7)：923-5.

16Ghosal S，Das S，Sen R，etal.Circ2Traits：a comprehensive database for circular RNA potentially associated with disease and traits〔J〕.Front Genet，2013；4：283.

17Lukim WJ.Circular RNA (circRNA) in Alzheimer′s disease (AD)〔J〕.Front Genet，2013；4：307.

18Bingol B，Sheng M.Deconstruction for reconstruction：the role of proteolysis in neural plasticity and disease〔J〕.Neuron，2011；69(1)：22-32.

19Lonskaya I，Shekoyan AR，Hebron ML，etal.Diminished parkin solubility and co-localization with intraneuronal amyloid-beta are associated with autophagic defects in Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimers Dis，2013；33(1)：231-47.

20Salzman J，Chen RE，Olsen MN，etal.Cell-type specific features of circular RNA expression〔J〕.PLoS Genet，2013；9(9)：e1003777.

21Burd CE，Jeck WR，Liu Y，etal.Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk〔J〕.PLoS Genet，2010；6(12)：e1001233.

22夏世金，邰先桃，李 炳，等.低氧性肺動脈高壓小鼠肺的環狀RNA表達譜研究〔J〕.中華肺部疾病雜志(電子版)，2015；8(1)：40-4.