馬鈴薯淀粉渣固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng)基優(yōu)化研究

張靚 劉香瑩 權(quán)桂芝 童應凱 張怡

摘? 要：利用馬鈴薯廢渣為主要原料，固體培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母菌。通過單因素實驗確定其最優(yōu)加水量為100%與接種量為10%，設(shè)計并實施了葡萄糖、硫酸銨、水、磷酸二氫鉀、硫酸鎂五因素四水平的正交實驗，發(fā)酵后測定菌數(shù)，確定了最佳的培養(yǎng)基配方：葡萄糖9%、磷酸二氫鉀0.1%、水與物料1：1，在此配方下，接種量10%，30℃培養(yǎng)48h，菌量最高可達6.63億個/g。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯;淀粉渣;固體發(fā)酵;產(chǎn)朊假絲酵母

中圖分類號：S532? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? DOI：10.11974/nyyjs.20181233001

中國是馬鈴薯生產(chǎn)大國，生產(chǎn)總量位居世界第一。近年來，由于我國淀粉加工業(yè)的飛速發(fā)展，馬鈴薯廢渣作為副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大。如果不能及時合理地處理掉，就會造成資源的浪費和環(huán)境的污染，是世界各國相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)和環(huán)境保護機構(gòu)有待解決的重要問題。產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）是優(yōu)良的生物飼料生產(chǎn)菌種，在飼料行業(yè)得到廣泛應用。本研究試圖以馬鈴薯淀粉廢渣為產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)料，進行固體發(fā)酵生產(chǎn)生物飼料，不僅能夠緩解蛋白原料短缺的現(xiàn)狀，還可以降低環(huán)境污染，變廢為寶。

1? ? ?材料與方法

1.1? ? ?材料

1.1.1? ? ?菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）是天津農(nóng)學院微生物實驗室保藏菌種。

1.1.2? ? ?培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基。

YEPD培養(yǎng)基（g）：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH6.0，115℃濕熱滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基。

基本固體培養(yǎng)基（%）：馬鈴薯廢渣60%、麩皮40%，水，121℃，20min。

1.1.3? ? ?主要儀器

8037-SGS超型自動壓力蒸氣滅菌器，T-500型電子天平，mA200電子天平，100～1000?l和10～100?l的微量移液器，恒溫培養(yǎng)振蕩器，電熱恒溫培養(yǎng)箱，生物顯微鏡，血球計數(shù)板，漩渦震蕩器。

1.2? ? ?試驗方法

1.2.1? ? ?斜面活化

將實驗室冰箱中保藏的菌種接種在斜面培養(yǎng)基上活化，30℃，培養(yǎng)48h。

1.2.2? ? ?種子培養(yǎng)

從斜面適量菌種到裝量為60mL/250mL三角瓶中，30℃，180r/min，培養(yǎng)20h。

1.2.3? ? ?發(fā)酵培養(yǎng)

以1mL接種量接入與種子培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，裝入250mL三角瓶內(nèi)，30℃，培養(yǎng)48h。

1.2.4? ? ?單因素試驗

為尋求產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)基中各組分對菌數(shù)影響的因素，從以下幾個方面進行試驗：從接種量與含水量確定固態(tài)發(fā)酵配方對菌數(shù)產(chǎn)生影響的最佳濃度，每個水平因素共有4個水平，每個水平有3個重復試驗（見表1）。

1.2.5? ? ?正交試驗

為了提高產(chǎn)朊假絲酵母的生長數(shù)量，培養(yǎng)基優(yōu)化采用五因素四水平L16（45）正交試驗，共設(shè)有16個處理，每個處理有3個重復試驗。麩皮、馬鈴薯廢渣兩種簡單有機碳源發(fā)酵實驗。根 據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、水與固料的比值做正交試驗。用250mL三角瓶裝固料10g包括麩皮4g，馬鈴薯廢渣6g，水10mL，攪拌均勻，用微量移液器加人1mL的產(chǎn)朊假絲酵母菌液，在30℃恒溫箱中進行48h發(fā)酵，利用血球計數(shù)板法觀察并記錄，最后篩選出優(yōu)化組合。（見表2）。

1.2.6? ? ?產(chǎn)朊假絲酵母固體發(fā)酵正交實驗設(shè)計（見表3）

按正交實驗表配以底料10g（馬鈴薯廢渣6g，麩皮4g）的培養(yǎng)基，加入不同比例的微量元素，并做3組重復。為使產(chǎn)朊假絲酵母菌能均勻分布到培養(yǎng)基中，可將產(chǎn)朊假絲酵母搖勻，然后向上述培養(yǎng)基中使用微量移液器加入1mL菌液。

接種好后把各組實驗放入30℃恒溫箱培養(yǎng)，48h后取出血球計數(shù)板法觀察記錄產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)。觀察產(chǎn)朊假絲酵母數(shù)量方法如下：攪拌均勻，從三角瓶中取出1g樣品，加入由離心管裝的10mL無菌水中，使用漩渦震蕩器將樣品充分混勻后，使附著于固體樣品表面的菌均勻穩(wěn)定分布在無菌水內(nèi)。再吸取1mL混勻菌液，加入9mL無菌水內(nèi)稀釋，加入100?l的美藍染色液，搖勻。將菌液放到血球計數(shù)板上，用40倍顯微鏡觀察，運用血球計數(shù)板（25×16）數(shù)菌數(shù)的方法，通過計算，便可得出菌種數(shù)量。

1.2.7? ? ?最佳配方重復

產(chǎn)朊假絲酵母菌的數(shù)量測定后，用極差分析出最佳結(jié)果，選出最佳培養(yǎng)基。重復最佳添加劑配方試驗，進行培養(yǎng)并測定菌數(shù)。

2? ? ?結(jié)果與分析

2.1? ? ?產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵條件的單因素試驗

2.1.1? ? ?不同接種量對菌數(shù)的影響

據(jù)有關(guān)文獻報道，接種量對產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)影響較大。選擇上述優(yōu)化的培養(yǎng)基9%的葡萄糖為碳源，0.1%的磷酸二氫鉀（其余成分同發(fā)酵培養(yǎng)基），選擇接種量在4 %～12%之間，數(shù)據(jù)（3次重復實驗平均值）結(jié)果表明菌數(shù)隨著接種量的增加而增大，接種量從4%增加到16%時，菌數(shù)從2.25億個/g增加到4億個/g，提高了56.3%。當接種量為16%時，其菌數(shù)表現(xiàn)出最高水平，為4億個/g（見圖1）。但由于10%～16%的趨勢平緩，且成本增高的原因，通過進一步進行試驗，確定10%的接種量在實際生產(chǎn)中的性價比與產(chǎn)值最優(yōu)，故最優(yōu)接種量為10%。

2.1.2? ? ?不同含水量對菌數(shù)的影響

在測試含水量的影響時，為了減少不同水份的濕重/干重的誤差，均計算為干重下菌數(shù)。用固料與加水量1：1、1：1.3、1：1.6、1：1.9的比例來配培養(yǎng)基，使之達到不同的含水量，選擇上述優(yōu)化的培養(yǎng)基9%的葡萄糖為碳源，0.1%的磷酸二氫鉀，其余成分同發(fā)酵培養(yǎng)基，數(shù)據(jù)（3次重復實驗平均值）結(jié)果表明在含水量80%～200%之間，含水量對菌數(shù)有一定的影響。在含水量120%時，菌數(shù)最高為3.51億個/g，在200%時，菌數(shù)最低為2.43億個/g，變化幅度為30.8%（見圖1）。因此，進一步試驗選擇含水量為100%。

2.1.3? ? ?單因素試驗小結(jié)

通過產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)的單因素試驗，得到菌種在葡萄糖9%，磷酸二氫鉀0.1%，pH6.0（其余成分同發(fā)酵培養(yǎng)基）接種量12 %，固料底物與加水量比值為1：1，30℃在培養(yǎng)箱發(fā)酵48h的培養(yǎng)條件下，其菌數(shù)可達到4億個/g。

2.2? ? ?正交試驗結(jié)果及極差分析

根據(jù)L16（45）正交試驗表，每一個處理均有3個重復試驗，結(jié)果及極差分析見表3。

2.3? ? ?正交試驗小結(jié)

從表3的分析中可知，葡萄糖（碳源）為主要的影響因素，葡萄糖濃度的變化對產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)影響最大，最適的葡萄糖濃度為9%;磷酸二氫鉀濃度的變化對產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)的影響次于葡萄糖的作用，以0.1%磷酸二氫鉀濃度最好;硫酸銨及硫酸鎂濃度的變化對產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)的影響不是很大。可能原因是麩皮和馬鈴薯廢渣中本身就含有這兩種微量元素。而磷酸二氫鉀與葡萄糖則需補充。

3? ? ?結(jié)論

單因素實驗測定出產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件的加水量是100%，接種量是12%。通過正交試驗的優(yōu)化組合，得到產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)的最優(yōu)培養(yǎng)條件是：葡萄糖9%，磷酸二氫鉀0.1%，水與固料比值為1：1，初始pH值6.0，接種量12%，加入10mL蒸餾水，以10g馬鈴薯廢渣與麩皮混合的培養(yǎng)基為固體底料，加入1mL產(chǎn)朊假絲酵母菌液，發(fā)酵溫度為30℃，培養(yǎng)48h，在此優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，產(chǎn)朊假絲酵母的菌數(shù)可達6.63億個/g。通過接種酵母菌進行固體發(fā)酵，轉(zhuǎn)化為生物飼料，可以有助于解決馬鈴薯淀粉廢渣的污染問題，變廢為寶。

參考文獻

[1]劉震，張微微，張永根.固態(tài)發(fā)酵馬鈴薯渣生產(chǎn)反芻動物飼料條件的篩選[J].中國奶牛，2013（20）：1-5.

[2]周芳.馬鈴薯渣發(fā)酵蛋白飼料的研究[D].烏魯木齊：新疆大學，2015.

[3]史春輝.馬鈴薯蛋白質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化能力強化的研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學，2013.

[4]張立宏，馮麗平，史春輝，等.酵母發(fā)酵馬鈴薯淀粉廢棄物產(chǎn)單細胞蛋白的能力強化[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2015（7）：9-15.

[5]張怡，劉敬為，童應凱.布拉酵母菌與凝結(jié)芽孢桿菌混合固體發(fā)酵的培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J].飼料工業(yè)，2016，37（22）：50-52.

[6]童應凱，韋東勝，劉婷，等.海洋紅酵母培養(yǎng)條件的研究[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（8）：75-79.

[7]童應凱，韋東勝.固體發(fā)酵工藝生產(chǎn)桿菌肽的研究[J].中國飼料，2007（7）：21-23

[8]宋平，張靚，趙寶頂，等.布拉酵母與蠟樣芽孢桿菌混合固體發(fā)酵的培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J].天津科技，2017，44（6）：61-64.