廣西云耳耐高溫菌株的室內篩選

陳雪鳳，吳圣進，龐 航，王燦琴，吳小建，韋仕巖*

(1. 廣西壯族自治區農業科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2. 賀州學院，廣西 賀州 542800)

【研究意義】木耳在廣西有500余年的栽培歷史，是廣西4大食用菌之一。由于近年黑木耳市場價格穩定，經濟效益明顯，因此其栽培面積日益擴大。目前廣西黑木耳主栽品種(如916，黑山，新科等)主要是來自北方或浙江、福建一帶的中低溫型品種，遇到廣西的暖冬氣候容易出現爛包，潮次減少，產量和品質下降等現象。云耳是廣西特有的中偏高溫型黑木耳品種，但受高溫氣候影響仍然較大，因此栽培區域有限，主要集中在桂西北、或桂北山區。篩選較耐高溫的云耳菌株，對擴大廣西云耳栽培區域、推進廣西云耳特色資源的開發利用具有重要意義。【前人研究進展】目前木耳耐高溫菌株篩選方面的研究主要有：劉佳寧等[1]、李紅等[2]、王進和陳文強[3]及高娃等[4]分別采取菌絲體熱激法、菌絲體耐高溫培養法、菌絲不同培養溫度出耳期耐高溫法進行黑木耳的耐高溫菌株篩選，并篩選出適合黑龍江、遼寧、陜西等地栽培的高溫菌株。李發盛等[5-6]、王燦琴等[7]對廣西百色野生云耳生態環境、生物學特性進行了研究并進行了馴化栽培；韋蘭英[8]和郎寧[9]利用本地化原料桑枝進行廣西云耳栽培技術研究，篩選出利用桑枝栽培云耳的高產栽培配方，總結出利用桑枝栽培云耳的栽培技術方法。【本研究切入點】有關黑木耳的研究主要集中在黑木耳食藥用成分提取、產品加工、高產栽培技術、高產菌株的選育方面，而對耐高溫菌株的篩選較少，特別是廣西野生云耳耐高溫品種篩選研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】通過觀察比較15個菌株在不同溫度下菌絲生長情況及在高溫條件下菌絲的恢復情況，篩選出菌絲體較耐高溫的菌株，獲得相對耐高溫的種質資源材料，為今后選育適合廣西地區栽培的耐高溫優良云耳品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株15個， 其中916為廣西主栽品種，來源于浙江麗水，其余菌株為廣西農業科學院微生物研究所野生分離所得，并于2015-2016年通過出菇試驗初步篩選。具體菌株編號為：YE1、YE2、HME2、TY013、TY024、TY026、TY041、TY051、TY063、TY071、TY072、TY073、YE(a)、YE(b)、916。

1.1.2 供試培養基 PDA綜合培養基：土豆200 g、 葡萄糖20 g 、瓊脂20 g 、七水硫酸鎂2 g、磷酸二氫鉀2 g、蒸餾水1000 mL，pH值為中性。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試菌株在不同溫度下的菌落生長情況比較 試驗設置6個溫度梯度(25，28，31，34，37，40 ℃)，每個處理設3 次重復。將活化6 d的菌株菌絲圓片(直徑6 mm)接種到PDA綜合培養基(培養皿直徑9 cm)中央，分別置于相應溫度的培養箱中培養7 d，觀察菌絲生長情況，測量菌絲生長速率，并進行統計分析。

菌絲生長速率 (mm/d) = 菌落半徑 (mm) / 生長天數 (d)

1.2.2 供試菌株在40 ℃下培養不同天數后恢復情況比較 將活化好的菌株菌絲圓片接種到PDA綜合平皿培養基中央，置于 40 ℃培養箱中分別培養 3、5、7和9 d后，再移出放置于28 ℃恢復培養7 d，每個處理設 3個重復，觀察菌絲生長情況，測量菌絲生長速率并統計分析。

1.2.3 云耳菌株耐高溫鍛煉情況比較 供試菌株活化6 d后，挑取菌落邊緣菌絲塊圓片接種于PDA綜合平皿培養基中央，置于40 ℃下培養5 d，取出在28 ℃下恢復培養7 d，然后挑選萌發生長較好的菌絲塊再接種于PDA綜合培養基上，42 ℃下培養3 d，取出在28 ℃下恢復培養7 d，再挑選萌發生長較好的菌絲塊接種于PDA綜合培養基上，置于45 ℃培養5 h后, 取出在28 ℃下培養7 d。各個溫度處理恢復生長7 d后，測量菌絲生長速率，并統計分析。

1.2.4 數據處理 數據采用DPS7.0軟件處理，采用Duncan’s 檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 供試菌株在不同溫度下菌落生長情況比較

由表1可見，所有供試菌株菌絲在25～37 ℃的培養條件下均能正常萌發生長，培養溫度為40 ℃時菌絲只能萌發，但不能生長。25～31 ℃時大部分菌株生長速率隨溫度升高而加快，31～37 ℃時生長速度逐漸下降。31 ℃時，菌絲生長較快的是TY026、HME2、YE1、TY071、YE2、YE (a)，其次是TY013、YE (b)、TY073、TY41，但菌絲生長較好的是HME2、TY026、YE1、TY071、YE2、TY041，因此在31 ℃下綜合生長情況較好的菌株是HME2、TY026、YE1、TY071、YE2。34 ℃時，菌絲生長較快的是TY026、HME2、TY041、TY013、YE2、YE (a)、YE (b)；菌絲生長較好的是HME2、TY026、YE1、TY071、TY041、YE2、YE (b)、TY013，因此在34 ℃下綜合生長情況較好的菌株是HME2、TY026、TY041、TY013、YE2、YE (b)。37 ℃時，菌落生長情況差異明顯，菌絲生長較快的是TY041、其次是YE (b)、YE (a)、TY072、TY026、TY073、HME2、YE1；菌絲生長較好的是TY041、HME2、TY026、YE1、YE (a)、YE (b) ，因此在37 ℃生長較好的菌株是TY041、YE (a)、YE (b)、TY026、HME2、YE1。

綜上所述，通過比較31～37 ℃各菌株菌落生長情況及菌絲的長勢可知，在高溫條件下生長較好且穩定的菌株為：HME2、TY026、YE1、TY041、YE2、YE (b)。

表1 供試菌株在不同培養溫度下的菌絲生長情況

注：同列數據后不同大寫字母表示相同溫度下不同菌株之間生長速率差異極顯著(P<0.01)；“ + ” 表示菌絲稀疏，生長較弱“ + + ” 表示菌絲較密、 生長勢較強; “ + + + ” 表示菌絲濃密、 生長旺盛。下同。

Note : Capital letters after the column datas indicate the difference in 1 % level of different strains at the same temperate by Duncan's test; + : Mycelium was sparse and grow weaker,+ + : Mycelium was dense and grow strong,+ + +: Mycelium was denser and grow stronger. The same as below.

2.2 供試菌株在40 ℃培養條件下培養不同天數后的恢復情況

由表2可見，菌株YE1、TY071、TY026、TY041、HME2在40 ℃下培養3、5 、7、 9 d之后，菌絲生長速率及長勢均比其他菌株好且穩定；菌株YE(b)、TY013、TY063、YE2雖然在個別處理中菌絲生長速率也快，但其速率不穩定或菌絲長勢較差。因此，在40 ℃條件下經不同天數培養處理，篩選到菌絲生長速度快且菌絲潔白致密的菌株5個：YE1、TY071、TY041、TY026、HME2。

2.3 云耳菌株耐高溫鍛煉情況

由表3可見，經過40 ℃培養條件下設置的高溫鍛煉方法處理后，菌株TY041、YE1、TY026、TY071、HME2的菌絲生長較快且菌落潔白致密，TY063菌絲生長速度雖快，但菌絲長勢不夠好，因此在40 ℃鍛煉條件下表現好的菌株為：TY041、YE1、TY026、TY071、HME2。

經42 ℃高溫培養鍛煉后，菌株TY026、TY073菌絲生長速度最快，其次是TY071、TY041、YE(b)、HME2、TY063，而菌絲長勢好的菌株有TY026、YE1、YE2、HME2、TY071、TY041、TY073，因此在42 ℃鍛煉條件下表現良好的菌株為：TY026、HME2、TY071、TY041 、TY073。

經45 ℃高溫培養鍛煉后，菌株TY026、TY041菌落生長速度最快，其次TY073、HME2、 TY071，而且菌絲也生長潔白致密，因此在45 ℃鍛煉條件下表現良好的菌株為：TY026、TY041 、TY071、TY073、HME2。

經40、42、45 ℃高溫鍛煉處理后，菌株TY041、TY026、TY071、HME2、TY073仍能在28 ℃適宜培養條件下穩定恢復生長，具有較好的耐高溫性。

3 討 論

食用菌育種的最終目的是獲得綜合性狀優良的新品種。而抗逆性是食用菌優良品種必備的重要性狀，它直接關系到栽培的成敗和經濟效益的大小。因此，除了豐產性和綜合商品性狀外，耐高溫、低溫性、抗病性、基質適應性等抗逆性的篩選、鍛煉是食用菌育種中種質創新的重要目標[10]。食用菌菌絲體的耐高溫性狀與豐產性緊密連鎖，因此耐高溫性狀的篩選同時也是豐產性狀的篩選[11]。在本研究的耐高溫性試驗中，表現比較好的菌株YE1、HME2、TY026、TY041、TY071 在2015-2016年出菇試驗中也是產量相對較高的品種。

表2不同云耳菌株在40 ℃條件下培養不同時間后菌絲恢復生長情況

表3 供試菌株高溫鍛煉后的菌絲長勢比較

本試驗的大部分云耳菌株菌絲在培養皿中經過40 ℃的高溫處理后轉移到28 ℃正常溫度培養，均能恢復正常生長，這說明云耳菌絲體的耐高溫性比較強。而在生產中當遇到35 ℃以上過高氣溫及環境條件調控不當的情況時，極易發生熱害爛包現象，其原因可能是在試驗中的菌絲受高溫處理一定時間后，恢復正常溫度培養，在培養皿中能及時散熱，而在生產中菌包受到高溫危害后，不能及時疏通散熱恢復正常生長條件，當溫度超過菌絲體耐受程度時，其活力下降甚至死亡。

在試驗中，野生分離的云耳中，半數以上的菌株經高溫條件下培養、鍛煉后，菌絲總體恢復生長能力比916好，說明廣西云耳菌株菌絲體在耐高溫性上具有優勢。

經過一系列的高溫培養、鍛煉，菌株TY026、TY041、HME2菌絲體的生長速度及菌絲長勢均相對較穩定。YE1雖然在42～45 ℃高溫鍛煉的兩個處理中表現稍差，但在25～37 ℃條件下及40 ℃培養不同天數條件下培養后的恢復情況均表現較好；TY071在37 ℃培養中表現一般，但在40 ℃培養不同天數條件下及40～45 ℃的高溫鍛煉中菌表現穩定且良好。

黑木耳的菌絲體對高溫有一定的忍耐性，菌絲體受短暫高溫影響后，都可以正常地恢復生長。品種對高溫條件忍受的時間越長、程度越大，說明該品種的耐高溫能力越強。在前人研究中[1-4]，菌絲體耐高溫篩選方法中，熱處理培養時間短、高溫條件單一、缺乏菌絲體由低溫到高溫的馴化適應性、穩定性鍛煉。而本研究在耐高溫菌株篩選中，采取了菌絲體在25～40 ℃不同梯度溫度培養、40 ℃高溫條件培養時間由3 d延長到9 d、從40～45 ℃高溫馴化鍛煉等3種方法進行試驗，綜合該3種方法篩選出的高溫菌株更具有代表性及穩定性。

不同種類的食用菌，同一種類的不同菌株，同一菌株的不同生育期，對高溫的耐受性不盡相同。品種的耐高溫性鍛煉和篩選，首先要從菌絲體的耐高溫性篩選開始，獲得相對耐高溫的品種后再進行農藝性狀的強化和穩定性測試。本研究中篩選出的幾個菌株，其菌絲體耐高溫表現較好，但在出菇期間的菌絲體及子實體是否同樣耐高溫，還有待進一步測試。

4 結 論

在一系列高溫條件的培養及處理下，云耳菌株TY026、TY041、HME2菌絲體的生長速度及菌絲長勢均表現相對較穩定，可以初步認定為菌絲體耐高溫品種。TY071、YE1也是菌絲體耐高溫性較好的菌株，可以與TY026、TY041、HME2一同進行出菇期間的耐高溫性測試。

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