鞘內注射TRESK過表達腺病毒抑制JNK活化和神經元凋亡減輕神經病理性疼痛

熊艷峰 林文靜 林森 黃振興 黃騰 王漢兵 楊承祥 仲吉英 周俊

佛山市第一人民醫院麻醉科（廣東佛山 528000）

神經病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由神經系統原發性損害和功能障礙所激發或引起的一種慢性疼痛，發病機制尚未完全闡明。離子通道改變形成異常放電的是NP痛覺異常主要原因，雙孔鉀離子通道TRESK（TWIK?related spinal cord potassium channels）在背根神經節（dorsal root gan?glion，DRG）中大量表達，TRESK下調可能參與多種慢性疼痛的病理生理過程［1-4］，本課題組的前期研究發現上調大鼠DRG的TRESK表達可明顯減輕NP［5］，但具體機制尚不清楚。最近研究表明，神經元的凋亡與NP密切相關［6］，而c?Jun 氨基末端激酶（Jun N?terminal kinase，JNK）是MAPK通路的重要信號通路，在細胞周期、凋亡等多種生理病理過程中發揮重要作用，已被證明與NP密切相關［7］。本研究通過鞘內注射TRESK基因重組腺病毒載體：pAd/CMV/V5?DEST?TRESK［8］，上調NP大鼠DRG的TRESK表達，觀察其對NP大鼠疼痛行為學以及DRG的JNK磷酸化和神經元凋亡的影響，進一步闡明TRESK介導的神經元凋亡參與NP的機制，為NP提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組 雄性SD大鼠72只，體質量200～250 g，由廣東省佛山市第一人民醫院實驗動物中心提供。采用隨機數字表法，將其分為6組（n=12）：空白對照組（C組）、假手術組（S組）、神經病理性疼痛組（NP組）、TRESK過表達腺病毒組（T組）、陰性腺病毒組（V組）和生理鹽水組（NS組）。NP組、T組、NS組和V組采用坐骨神經分支選擇性損傷（SNI）大鼠模型。T組、V組和NS組于造模后分別在鞘內注射TRESK基因重組腺病毒（pAd/CMV/V5?DEST?TRESK）、陰性腺病毒和等容量生理鹽水。

1.2 SNI模型的建立 NP組、T組、NS組和V組大鼠均取左側行SNI模型［9］；S組手術操作與NP組相同，但不結扎神經。各組大鼠術后腹腔注射青霉素20萬U預防感染。

1.3 鞘內注射 在大鼠的L4，5椎間隙進行鞘內注射：T組大鼠鞘內注射TRESK基因重組腺病毒pAd/CMV/V5?DEST?TRESK（109IU/mL），V 組大鼠鞘內注射陰性腺病毒，劑量均為25 μL；NS組大鼠鞘內注射生理鹽水。

1.4 機械性縮足反射閾值（MWT）和熱縮足潛伏期（TWL）測定 各組大鼠分別于術前1 d（BL）和術后1、3、7和14 d（D1、D3、D7、D14）分別測定左后肢MWT和TWL。用Von?Frey纖維絲（Stoelting公司，美國）測定MWT，測量5次，每次間隔10 min，取均值，該值即為機械痛閾值［10］。BME?40A型熱痛刺激儀（中國醫學科學院生物工程研究所）以熱輻射法測定TWL，測量5次，每次間隔10 min［11］。

1.5 Western blot檢測大鼠DRG的TRESK、p?JNK、JNK和Caspase3蛋白表達 于造模后7 d（D7）痛閾測定結束后，每組斷頭處死6只大鼠，分別取L4～5節段背根神經節組織；造模后14 d痛閾測定結束，每組斷頭處死剩余6只大鼠，分別取L4～5節段脊髓組織。組織均于-80℃保存，Western blot分別檢測大鼠DRG的TRESK、Caspase3、p?JNK和JNK蛋白表達。

1.6 DRG凋亡細胞檢測 TUNEL標記法檢測DRG凋亡神經元細胞。造模后14 d（D14）痛閾測定結束，每組各取6只大鼠，10%水合氯醛麻醉下剖胸暴露心臟，經心尖部插管灌流固定，依次灌注生理鹽水、4%多聚甲醛，取L4～5DRG組織置于30%多聚甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋，橫斷5 μm連續切片。TUNEL染色后二甲苯透明中性樹脂封片，光鏡下觀察并TUNEL陽性細胞（細胞核棕褐色染色）。每只大鼠取5張DRG切片，用奧林巴斯倒置顯微鏡（Olympus C7070wz，日本）觀察，應用圖像分析儀分析并計算細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.7 統計學方法 用SPSS 10.0統計軟件進行統計分析。計量資料以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MWT與TWL比較 各組各時點的TWL組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；NP組、T組、V組、NS組D1、D3、D7、D14時的MWT明顯低于C組、S組（P＜0.05）；與NP組、V組、NS組相比，T組D1、D3、D7、D14時的MWT的明顯升高（P＜ 0.05）；T組、V組、NS組D1、D3、D7、D14時的MWT組間比較差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

2.2 各組大鼠DRG的TRESK蛋白表達比較 與C組、S組相比，NP組、V組和NS組L4～5術側DRG的TRESK蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；TRESK組L4～5術側DRG的TRESK蛋白表達明顯高于NP組、V組、NS組（P＜0.05）；T組、V組、NS組的TRESK蛋白表達組間比較差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

表1 各組大鼠不同時點PWT和TWL的比較Tab.1 Comparation of PWT and TWL in each group rats at different time points ±s

表1 各組大鼠不同時點PWT和TWL的比較Tab.1 Comparation of PWT and TWL in each group rats at different time points ±s

注：與C、S組比較，aP ＜0.05；與NP、V、NS組比較，bP ＜0.05

MWT（g）TWL（s）組別C組S組NP組T組V組NS組BL 13.3±1.3 13.4±1.8 13.6±1.6 13.7±1.2 13.8±1.4 13.0±1.7 D1 13.4±1.0 13.9±1.9 8.5±1.1a 10.7±1.3ab 8.7±1.3a 8.4±1.0a D3 13.2±1.5 13.5±1.2 6.2±1.0a 8.8±1.2ab 6.0±0.8a 6.1±1.0a D7 13.2±1.0 13.5±1.3 5.1±0.9a 8.0±1.6ab 5.0±0.8a 5.2±1.0a D14 13.6±1.3 13.3±0.8 4.9±1.1a 8.5±1.3ab 4.8±0.8a 5.0±1.1a BL 17.7±2.0 17.6±1.6 17.5±2.1 18.0±2.1 17.9±2.1 17.3±2.0 D1 17.9±2.0 17.7±2.0 17.8±1.8 17.5±1.6 17.8±1.7 17.4±2.0 D3 17.3±1.6 17.5±2.2 17.3±2.0 17.8±1.3 17.3±1.2 17.6±1.6 D7 17.5±2.0 17.1±1.6 17.6±2.1 18.2±2.3 17.9±2.0 17.4±1.3 D14 17.7±2.2 17.0±1.8 17.2±1.8 17.3±2.2 17.7±2.4 17.0±1.8

表2 各組大鼠背根神經節組織TRESK蛋白表達的比較（n=6）Tab.2 Comparation of TRESK expression in DRG of each group rats ±s

表2 各組大鼠背根神經節組織TRESK蛋白表達的比較（n=6）Tab.2 Comparation of TRESK expression in DRG of each group rats ±s

注：與C、S組比較，aP ＜0.05；與NP、V、NS組比較，bP ＜0.05

指標C組S組NP組T組V組NS組TRESK蛋白1.34±0.11 1.41±0.13 0.41±0.08a 1.05±0.21b 0.37±0.15a 0.44±0.16a

表3 各組大鼠DRG的JNK磷酸化水平比較（n=6）Tab.3 Comparation of JNK phosphorylation in DRG of each group rats ±s

表3 各組大鼠DRG的JNK磷酸化水平比較（n=6）Tab.3 Comparation of JNK phosphorylation in DRG of each group rats ±s

注：與C、S組比較，aP ＜ 0.05；與NP、V、NS組比較，bP ＜0.05

指標C組S組NP組T組V組NS組p?JNK/JNK 0.13±0.04 0.15±0.05 1.21±0.13a 0.76±0.08ab 1.32±0.15a 1.26±0.12a

表4 各組大鼠DRG神經元凋亡比較（n=6）Tab.4 Comparation of neuronal apoptosis in DRG of each group rats ±s

表4 各組大鼠DRG神經元凋亡比較（n=6）Tab.4 Comparation of neuronal apoptosis in DRG of each group rats ±s

注：與C、S組比較，aP ＜ 0.05；與NP、V、NS組比較，bP ＜0.05

指標C組S組NP組T組V組NS組Caspase?3蛋白0.42±0.04 0.38±0.05 1.38±0.12a 0.86±0.07ab 1.32±0.16a 1.27±0.18a細胞凋亡率（%）0.97±0.03 1.01±0.04 41.23±5.16a 19.82±4.33ab 44.17±6.18a 40.16±5.73a

2.3 各組大鼠DRG的JNK磷酸化比較 與C組、S組相比，NP組、T組、V組和NS組L4～5DRG的JNK磷酸化水平明顯增高（P＜0.05）；與NP組、V組、NS組相比，T組L4～5DRG的JNK磷酸化水平明顯降低（P＜ 0.05）；T組、V組、NS組的L4～5DRG的JNK磷酸化水平組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 各組大鼠DRG神經元凋亡比較 與C組、S組相比，NP組、T組、V組和NS組L4～5DRG的細胞凋亡率和Caspase?3表達明顯增高（P＜ 0.05）；與NP組、V組、NS組相比，T組L4～5DRG的細胞凋亡率和Caspase?3表達明顯降低（P＜ 0.05）；T組、V組、NS組的L4～5DRG的細胞凋亡率和Caspase?3表達組間比較差異無統計學意義（P＞0.05，表4）。

3 討論

SNI動物模型的特點是具有顯著異常機械痛敏，但無熱痛閾變化。該模型更接近NP的臨床特征，是一種較理想的NP模型。本研究制備SNI模型可重復性高，與前期研究行為學一致［5］：各組大鼠均在術后1 d即開始表現為機械痛敏，而并不表現熱痛超敏，符合SNI模型典型的行為學特征。

雙孔鉀離子通道亞型TRESK在大鼠DRG大量表達，主要功能是維持神經元細胞的靜息電位，在神經元細胞的興奮過程中起重要作用。本課題組前期研究構建的TRESK基因重組腺病毒載體pAd/CMV/V5?DEST?TRESK，已證明在離體和在體均具有可靠的轉染效率和上調TRESK目的基因的效果［11-12］。本試驗所有實施SNI手術的組別TRESK蛋白均下調，而給予pAd/CMV/V5?DEST?TRESK的TRESK大鼠背根神經節的TRESK的表達明顯上調。另外，與NP組比較，T組的MWT升高，再次驗證了上調SNI大鼠DRG的TRESK表達可減輕大鼠NP。

NP脊髓水平的神經元的凋亡、炎性反應，已被多個研究證實在NP中發揮重要作用，多型NP均伴有背根神經節和脊髓神經元的凋亡［13］，其機制可能為：抑制性中間神經元的凋亡減少了其對傷害性信息傳遞的抑制作用，導致背根神經節向脊髓傳導的痛覺傷害性神經元興奮增高，從而產生痛覺過敏［14］。而JNK是介導MAPK磷酸化的重要信號通路，也介導了炎癥反應和凋亡的過程，因此，筆者推測JNK與NP之間有聯系。同時，已有學者認為脊髓水平的MAPK磷酸化通過調節炎性反應和神經元凋亡參與了慢性疼痛的機制［15］。本研究觀察了SNI大鼠TRESK下調對DRG凋亡神經元的影響，結果SNI大鼠伴隨著DRG的TRESK下調，凋亡細胞和凋亡相關蛋白Caspase?3明顯上調，而上調DRG的TRESK表達后，SNI大鼠的凋亡明顯減輕，說明神經元的凋亡介導了NPDRG的TRESK機制，也證實TRESK是下游通路，通過介導JNK信號來發揮作用。

細胞內鉀離子外流是細胞凋亡的重要特征之一。在許多病理條件下，胞內鉀離子濃度降低可以引起神經元凋亡，鉀通道阻斷劑或胞外高鉀可以阻斷神經元凋亡。鉀離子通道TRESK是DRG最主要的背景鉀離子通道，DRG的TRESK下調改變神經元興奮性，通過突觸傳遞等方式將疼痛信號傳遞到中樞，參與多型疼痛的發病機制。JNK在細胞周期、凋亡等多種生理病理過程中發揮重要作用，與NP密切相關［6］，而TRESK參與的慢性疼痛機制也與JNK、神經元凋亡有相關性。結合本試驗中DRG的JNK磷酸化結果，筆者推測在NP發病機制中，DRG的TRESK通過JNK磷酸化引起神經元凋亡，從而介導了痛敏的發生。

綜上所述，TRESK介導大鼠的神經病理性痛機制可能與背根神經節JNK磷酸化和神經元凋亡有關。本實驗驗證了K+通路TRESK在NP中發揮了重要的作用，并且其介導了下游通路。在今后的臨床工作中，通過特異性離子通道抑制劑、信號下游通道的抑制劑或激動拮抗劑來達到治療NP的效果，也是今后的研究方向［16］。

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