小兒特發性心肌病91個心肌病相關基因檢測分析

張力力 王樹水 辛穎 張智偉 李渝芬

1南方醫科大學（廣州 510515）；2廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院，廣東省心血管病研究所心兒科（廣州 510080）

特發性心肌病是原發于心肌病變的心臟結構和功能的異常，包括擴張型心肌病（dilated cardio?myopathy，DCM）、肥厚型心肌病（hypertrophic car?diomyopathy，HCM）、左室心肌致密化不全（left ventricular noncompaction，LVNC）等。DCM表現為心臟擴大，心室收縮功能減退，伴或不伴有充血性心力衰竭，常有心律失常，可伴發栓塞、猝死等并發癥。HCM是以不能解釋的心室肥厚為特征的心肌疾病，早期伴心臟舒張功能不全，晚期收縮功能亦受影響，左室流出道梗阻是該病的常見特征，它是最常見的年輕人心源性猝死的原因之一。LVNC是以心室內疏松的肌小梁和深陷的隱窩為特征的心肌病，常累積左室，又稱海綿狀心肌、竇狀心肌持續狀態等。近年來，隨著二代測序技術的發展，從基因層面診斷疾病，分析基因突變與臨床表型的關系已成為研究熱點［1］。本文對我院接診的43例無血緣關系的特發性心肌病兒科患者進行心肌病相關基因進行研究，系首次對特發性心肌病患兒進行多達91個心肌病相關基因的測序分析，以明確特發性心肌病患兒致病基因及其突變特點，初步分析基因突變與臨床表型的關系，探討基因突變在心肌病診斷、預后判斷、指導治療方面的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 廣東省人民醫院從2015年1月至2017年3月共收治43例無血緣關系心肌病患兒（DCM 14例，HCM12例，LVNC17例），全部病例經酶學及串聯質譜檢查等排除代謝性心肌病，經臨床、超聲心動圖檢查確診。DCM中，男8例，女6例，年齡0.3～14（6.4±5.4）歲。HCM中，男4例，女8例，年齡0.3～14（6.3±4.9）歲。LVNC中，男7例，女10例，年齡0.2±13（4.0±4.5）歲。本研究經廣東省人民醫院醫學研究倫理委員會批準，所有患兒及直系親屬，均由其本人或監護人簽署知情同意書。

1.2 基因測序分析

1.2.1 二代基因測序 抽取靜脈血2 mL，采用QIAamp DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）抽提基因組DNA。提取的DNA用DNA酶片段化后用磁珠法進行純化，隨后進行PCR擴增并連接上接頭序列，使用 TruSight One Sequencing Panel（illumina Inc，USA）試劑盒經2次捕獲及純化，再經PCR擴增和純化后獲得的最終文庫在Nextseq500測序儀（illumina Inc，USA）上進行外顯子區及外顯子與內含子交接區的二代測序。

1.2.2 數據分析 根據既往文獻報道［2-4］和HGMD（Human Gene Mutation Database）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Men）等數據庫選取與心肌病相關或可能相關的91個基因進行分析。該91個基因為 AARS2、ABCC9、ACTC1、ACTN2、AGK、ANKRD1、BAG3、CALR3、CASQ2、CAV3、CHRM2、COX15、 CRYAB、 CSRP3、 CTF1、 DES、 DMD、DNAJC19、DOLK、DSC2、DSG2、DSP、DTNA、ELAC2、EMD、EYA4、FHL1、FHL2、FKTN、FLT1、FOXD4、FXN、GATAD1、GLA、ILK、ISL1、JPH2、JUP、KLF10、LAMA2、LAMA4、LAMP2、LDB3、LMNA、MAP2K2、MRPL3、MTO1、MURC、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYO6、MYOM1、MYOZ2、MYPN、NDUFAF1、NDUFS7、NEBL、NEXN、PDLIM3、PKP2、PLN、PRKAG2、PSEN1、PSEN2、RBM20、RYR2、SCN5A、SGCA、SGCD、SLC25A3、SLC25A4、SRI、SYNE1、SYNM、TAZ、TCAP、TGFB3、TMEM43、TMPO、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、TXNRD2、VCL。用BWA算法比對到參考序列（UCSC hg19），采用儀器默認設置，使用ANNOVAR工具對數據進行注釋。使用千人基因組計劃數據庫、ESP6500數據庫、HGMD數據庫進行篩選、注釋；使用SIFT、Polyphen?2軟件進行錯義變異的生物信息學分析。綜合各個基因變異的頻率、基因功能、遺傳方式、文獻報道等信息，并結合患兒的臨床表型信息，篩選候選突變。根據2015年“美國遺傳學與基因組學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）”提出的指南得出致病性判斷，基因突變的致病性程度分為5檔，即致病突變、可疑致病突變、臨床意義未明、可能無害、無害［5］。

1.2.3 Sanger測序驗證 針對候選突變的位點，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，對其中收集到靜脈血的一代親屬進行相應位點的Sanger測序驗證。

2 結果

2.1 特發性心肌病基因突變情況 43例患兒（DCM 14例，HCM 12例，LVNC 17例）中，20例（46.5%）檢測到 ACTC1、DSG2、ELAC2、FKTN、HCN4、LAMA2、LMNA、MTO1、MYBPC3、MYH6、MYH7、NEBL、NEXN、NKX2?5、PLN、PSEN2、RAF1、SCN5A、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL等 23個基因上的致病突變和可疑致病突變，共檢測到28個致病突變或可疑致病突變位點，未見有重復出現的突變位點（表1）。其中6例患兒同時檢測到2個基因上致病突變或可疑致病突變，2例患兒同時檢測到1個基因的2個致病突變或可疑致病突變。對其中24個突變位點進行父母測序驗證發現，由父或母遺傳的有19個，新發突變5個。致病突變和可疑致病突變中，突變方式以錯義突變為主，占50.0%，其次為移碼突變（17.8%）、無義突變（14.3%）、剪接突變（10.7%）、外顯子和內含子交接區的微小缺失突變（3.5%）。此外，19例（44.1%）患兒檢測到臨床意義未明的突變位點。

2.2 DCM與基因突變 14例DCM患兒中，5例（35.7%）檢測到7個基因上的8個致病突變及可疑致病突變位點，余9例均檢測到臨床意義未明的突變。1例DCM患兒中檢測到FKTN基因上的2個位點的突變，FKTN?L166P來自于父親，FKTN?F369fs來自于母親，父母均無心臟擴大或心力衰竭的表現，但該患兒就診時即有嚴重的心力衰竭。

2.3 HCM與基因突變 12例HCM患兒中的7例（58.3%）檢測到10個基因上的11個致病及可疑致病突變位點，3例檢測臨床意義未明的突變。對其中1例有暈厥史，且就診2年后因心力衰竭死亡的患兒（病例17，圖1）進行家系分析發現，其母親、妹妹、外婆攜帶致病突變MYH7?R663C，其父親、伯父攜帶可疑致病突變MYH7?R1050*，均未患病，其姐姐診斷為HCM已于4歲猝死，未能檢測到其姐姐基因。1例患兒父親不明原因猝死，后發現該患兒心肌肥厚且檢測到致病突變TNNT2?R130C，患兒母親未攜帶此突變。還有1例HCM患兒檢測到PKP2基因上的R284G位點突變，該位點根據ACMG指南判斷為臨床意義未明，但通過患兒家系驗證發現，該位點為新發突變，其父、母均未攜帶此突變位點。

表1 特發性心肌病基因型與臨床表型Tab.1 Genotype and phenotype of cadiomyopathy

2.4 LVNC與基因突變 在17例LVNC的患兒中，8例（47%）檢測到9個基因上的9個致病及可疑致病突變位點。7例檢測到臨床意義未明的突變，2例患兒僅檢測到無害和可能無害的突變位點。對1例（病例9，圖2）患兒進行家系分析發現，該患兒攜帶的突變ACTC1?c.616+1G＞C為新發突變，其兄長、父、母均不攜帶此突變。1例合并有竇性心動過緩的患兒檢測到致病突變HCN4?G482R。

3 討論

本文首次對特發性心肌病患兒進行多達91個心肌病相關基因的測序分析，明確特發性心肌病患兒致病基因及其突變特點，初步分析基因突變與臨床表型的關系，探討基因突變在心肌病診斷、預后判斷、指導治療方面的作用。研究發現DCM與48個基因的突變有關，40%～50%的家族性DCM可以檢測到基因突變［6］，其中最常見的突變基因為TTN，約占20%，其次為LMNA（6%），MYH7（4.2%），MYH6（3 ～ 4%），SCN5A（2 ～ 4%）等［7］，本研究中14例DCM患兒中5例檢測到致病基因突變和可疑致病突變，大部分為非家族性的DCM，我們檢測到常見基因LMNA，還檢測到TPM1、VCL、PLN、DSG、PSEN2、FKTN 等致病基因。在HCM中，已經報道了26個致病基因，50%～60%的家族性HCM，20%～30%的非家族性HCM可以檢測到基因突變［8］。研究表明在HCM的致病基因中 MYH7、MYBPC3約各占 40%，TNNI3、TNNT2約各占 5%，TPM1約占 2%［9］，本研究在12例HCM患兒中7例檢測到致病突變及可疑致病突變。我們也同樣檢測到MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3上的突變位點，與文獻報道相符。此 外 ，還 檢 測 到 TTN、RAF1、PSEN2、LAMA2、NEXN、MTO1等基因的突變位點。LVNC與15個基因突變相關，15% ～50%的LVNC為家族遺傳［10］。常見的LVNC致病基因有DTNA、MIB1、PRDM16、TNNT2、TAZ等［11］。本研究檢測到的致病基因包括 ACTC1、ELAC2、HCN4、LMNA、MYH6、NEBL、NKX2?5、SCN5A、TTN。

圖1 1例HCM患兒超聲心動圖及基因測序圖Fig.1 Images for a patient of HCM

圖2 1例LVNC患兒超聲心動圖及基因測序圖Fig.2 Images for a patient of LVNC

根據既往文獻報道和相關數據庫選擇了與心肌病相關或可能相關的91個基因進行測序分析［1-3］。在本研究的43例特發性心肌病患兒中，20例（46.5%）檢測到致病或可疑致病突變位點，19例（44.1%）檢測到目前臨床意義尚未明確的突變位點。這些研究結果提示，將心肌病相關基因檢測用于協助診斷特發性心肌病是可行的。特發性心肌病患兒中大部分都能檢測到突變位點，但其中存在臨床意義未明的位點，我們的研究結果顯示，這些臨床意義目前尚未明確的突變位點很可能與患兒的發病密切相關，需要今后進一步的分析。本研究中，1例HCM患兒檢測到PKP2基因上的R284G位點突變。雖然根據目前的判斷標準，該突變尚定義為臨床意義未明的突變位點，但該位點為新發突變，具有較強的致病證據，很可能與HCM發病相關。在既往研究中，PKP2?R284位點未見有引起HCM的報道，但PKP2基因的突變影響橋粒功能，是引起右室心肌病的常見致病基因，因而我們懷疑R284G為新發現的HCM的致病位點，需要進行下一步的驗證。

文獻報道，部分基因突變位點與病變程度相關。有研究結果顯示攜帶一個基因上的雙突變位點是患兒預后不良的標志［12-13］。本研究中1例DCM患兒攜帶FKTN的雙突變位點，其分別來自于父母，該患兒父母無心臟擴大或心力衰竭等表現，但患兒就診時即有嚴重的心力衰竭，且治療后未見明顯好轉，支持其預后不良的特點。另1例HCM患兒攜帶有MYH7的雙突變，她是本研究HCM病例中唯一一例死亡的患者，該患兒10歲時就有胸痛、心衰等表現，12歲因心力衰竭死亡，其姐姐在4歲因HCM猝死，支持文獻報道的該類病例具有病情重、預后差的特點。因此，對于檢測到一個基因上雙突變位點的病例，應密切隨訪，并早期告知家屬其預后情況。HCM中，TNNT2的突變位點R92Q，R92W，R130C等引起的心肌肥厚不嚴重，但易引發心源性猝死［14］。本研究中檢測到的TNNT2?R130C的突變的患兒心肌肥厚亦不嚴重，其母親未攜帶此突變，父親已于30歲猝死，高度懷疑其猝死與此突變相關，該患兒目前無臨床癥狀，但根據其基因型與家族猝死史，臨床應予以密切關注，加強隨訪，必要時應早期應用置入性心臟除顫器預防猝死。MILANO等［15］曾發現HCN4?G482R突變的LVNC患者常合并有竇性心動過緩，本研究中有1例LVNC患兒也檢測到了HCN4?G482R突變，該患兒同樣具有顯著的心動過緩，而本文中其他LVNC病例均不合并明顯的竇性心動過緩。

由于受到研究經費、研究時間等方面的限制，本研究尚有一些突變位點目前未能明確是否致病，突變位點與臨床表型的關系也未得到大樣本的驗證。今后，將對研究病例進行長期隨訪、擴大樣本量，以上述問題進行深入研究。

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