基于血清細胞因子的PLS?DA模型對兒童肺炎支原體肺炎的診斷價值

黃飛燕 劉春艷 朱紅楓

西南醫科大學附屬醫院兒科（四川瀘州 646000）

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是兒童和青少年最常見的下呼吸道感染性疾病，主要引起社區獲得性肺炎，嚴重者可導致患兒死亡［1-2］。MPP患兒早期癥狀不典型且胸片多無特異性，故臨床易漏診、誤診。MPP的發病是炎癥因子與抗炎因子共同作用的結果［3］，故研究血清細胞因子水平變化有助于MPP患兒的輔助診斷。目前，血清細胞因子診斷MPP患兒的相關報道較少，也鮮有基于血清多種細胞因子的模式識別技術對MPP的診斷和預測分析。偏最小二乘判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS?DA）是常用的模式識別技術，用于揭示多指標的綜合作用，輔助診斷疾病?；诖?，本研究以兒科病房收治的MPP患兒為研究對象，基于血清白介素?2（interleukin?2，IL?2）、IL?4、IL?6、IL?8、IL?10，TNF?α及干擾素γ（IFN?γ）水平建立PLS?DA模型，為全面、深入了解MPP患兒體內免疫狀況、輔助診斷MPP和預測分析提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2016年12月西南醫科大學附屬醫院兒科病房收治的MPP患兒140例為觀察組，男85例、女55例，年齡2～10歲、平均5.9歲。MPP診斷參照第8版《諸福棠實用兒科學》［4］和兒童社區獲得性肺炎管理指南（2013年）修訂版［5］。納入標準：（1）出現上呼吸道感染癥狀；（2）X線檢查肺部呈多樣改變；（3）外周血白細胞數正常或升高，單份血清MP?IgM滴度≥1∶160或雙份血清MP?IgG抗體滴度升高≥4倍；（4）咽試紙 MP?聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）陽性。排除標準：（1）細菌性、病毒性肺炎，肺結核及支氣管哮喘患兒；（2）主要臟器疾病（如肝腎功能不全）或免疫缺陷疾病患兒；（3）入組前1個月接受過抗生素或免疫調節藥物治療的患兒。選擇同期體檢健康兒童135例為對照組，男79例，女56例，年齡1～10歲，平均5.6歲。兩組性別構成比、年齡均具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會審核，受試者監護人均知情同意。

1.2 血清炎癥相關細胞因子檢測 觀察組入院治療前、對照組體檢時抽取空腹靜脈血3～5 mL，3 500 r/min離心15 min后分離血清，-20℃保存。采用 ELISA 法檢測血清 IL?2、IL?4、IL?6 IL?8、IL?10、TNF?ɑ及IFN?γ水平，配套試劑盒購于廣州展晨生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 血清炎癥相關細胞因子對MPP的診斷效能分析 繪制上述7種血清炎癥相關細胞因子診斷MPP的受試者工作特征（ROC）曲線，計算曲線下面積（AUC）、敏感性、特異性及臨界值，評價7種血清炎癥相關細胞因子對MPP的診斷效能。

1.4 PLS?DA診斷和預測模型的建立 采用歸一化法即［（測定值-均值）/標準差］對數據標準化處理以消除單位或量綱差異。以特征根提取前兩個PLS 成分即 t［1］和 t［2］并作圖，揭示個體的空間分布差異，并進一步建立基于血清7指標的PLS?DA方程。將每一個體的7項測定值分別帶入方程，以得分值（擬合概率P）＞0.50判定為觀察組（＜0.50判定為對照組）計算模型的診斷準確率。采用20次交叉驗證法對每一個體代入驗證，計算模型的預測準確率。以累積的因變量指數（R2Y）和交叉驗證的有效性指數（Q2）評估PLS?DA模型的診斷和預測能力，其中R2Y和Q2均＞0.5，表明建立的模型穩定、可靠；采用置換檢驗判斷模型是否過度擬合，置換驗證圖中R2的截距應＜0.3，Q2的截距應 ＜ 0.05［6］。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0和SIMCA P?11.5統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清炎癥相關細胞因子水平比較 觀察組血清IL?2、IL?4、IL?6、IL?8、IL?10、TNF?ɑ及IFN?γ水平均高于對照組（P＜0.05或＜0.01），見表1。

表1 疾病組和對照組血清細胞因子水平比較Tab.1 Comparison of serum level of cytokines between the disease group and the control group ±s，pg/mL

表1 疾病組和對照組血清細胞因子水平比較Tab.1 Comparison of serum level of cytokines between the disease group and the control group ±s，pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

組別觀察組對照組t值P值IL?2 10.4±3.4*8.63±3.0 2.297 0.036 IL?4 6.97±2.2*4.81±1.8 2.326 0.023 IL?6 19.3±6.6*11.1±5.7 2.901 0.011 TNF?8 22.4±7.4#12.6±6.3 11.757 0.000 IL?10 21.3±10.3#11.6±6.2 9.613 0.000 TNF?α 23.3±8.3#14.1±6.0 2.755 0.008 IFN?γ 53.5±29.6#22.3±21.0 10.062 0.000

表2 血清7種細胞因子對MPP的診斷效能Tab.2 The diagnostic performance of serum seven cytokines for MPP pg/mL

2.2 血清7種細胞因子對MPP的診斷效能分析 7種血清細胞因子中受試者工作特征曲線下面積（AUC）最高的指標為IL?10和IFN?γ（AUC均為0.84，均P＜ 0.05）。IL?10在臨界值為12.15 pg/mL時診斷MPP的敏感度和特異度分別為91.4%和77.0%。IFN?γ在臨界值為24.95 pg/mL時診斷MPP的敏感度和特異度分別為82.1%和82.2%（表2）。

2.3 血清炎癥相關細胞因子診斷MPP的PLS?DA模型 以血清7種炎癥相關細胞因子建立PLS?DA模型，該模型的R2Y和Q2分別為0.597和0.556，置換驗證圖中R2的截距為0.001，Q2的截距為-0.078（圖1）。PLS?DA模型表明，觀察組個體空間分布 離散，主要分布在橢圓的2，3象限而對照組個體分布較集中，主要分布在1，4象限，兩組個體有分離的趨勢（圖2）?；谘?種炎癥相關細胞因子的PLS?DA方程式為P=0.161× IL?2+0.185×IL?4+0.205 × IL?6+0.223 × IL?8+0.156 × IL?10+0.096×TNF?α +0.180×IFN?γ。該模型對觀察組和對照組的診斷準確率分別為90.0%（126/140）、88.15%（119/135），內代法預測的準確率分別為86.4%（121/140）、87.4%（118/135）。

圖1 PLS?DA模型置換驗證圖Fig.1 The replacement verification diagram in the PLS?DA model

圖2 基于血清7種炎癥相關細胞因子的PLS?DA模型Fig.2 The PLS?DA model based on serum seven inflammation related cytokines

3 討論

人體免疫系統對入侵體內的MP可產生免疫反應，其中細胞免疫在MPP的發病機制中具有重要作用。MPP感染后血清炎癥相關因子如IL?1、IL?6、IL?12、IL?17、TNF?α及IFN?γ等顯著升高，出現細支氣管上皮細胞空泡變性與細胞毒作用并引起氣道高反應性和持續氣道阻塞［7］。研究［8］表明，MPP患兒血清IL?6、IL?8水平顯著增高且與預后密切相關，其中血清IL?6水平可反映肺功能和肺部感染的嚴重程度［9］。LI等［10］研究表明，IL?6對MPP有較高的診斷效能（AUC為0.729，95%CI為0.678～0.780），敏感性和特異性分別為62.8%、95.3%，與本研究結果相似。炎癥因子IL?8對中性粒細胞和T淋巴細胞均可產生強烈的趨化作用，炎癥細胞在受累組織聚積和浸潤并釋放活性物質，導致組織損傷［10］。IL?10是抗炎因子，可抑制TNF?α、IL?6和IL?8的釋放而對抗感染［11］，故本研究疾病組MPP患兒血清IL?8和IL?10水平均顯著高于對照組。IFN?γ主要由Th1細胞產生，通過活化單核細胞和巨噬細胞清除MP，促進細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞抗MP感染作用［12］，而TNF?α是一種炎癥介質，其免疫作用與其血清水平高低有關，高水平TNF?ɑ導致組織損傷［13］。本研究中，疾病組血清 IL?2、IL?4、IL?6、IL?8、IL?10、TNF?α 及IFN?γ水平均高于對照組，表明MP感染可引起機體炎癥因子和抗炎因子水平升高，在組織損傷中和修復中發揮潛在作用。

MPP的發病過程是炎癥因子和抗炎因子共同作用的過程，孤立地比較各因子的水平變化尚不能全面了解MPP患兒的免疫狀態。PLS?DA是代謝組學中常用的模式識別技術，可全面、深入了解疾病狀態下患者體內多種代謝物的變化過程，有助于疾病的輔助診斷和預測分析［14］。目前，尚未見PLS?DA模型用于MPP患兒免疫功能研究和輔助診斷的相關報道。本研究中MPP患兒體內免疫平衡被打破而正常對照組兒童體內免疫處于平衡狀態，故PLS?DA模型中個MPP患兒分布更離散且空間分布完全不同于正常兒童。MPP時細胞因子IL?1、IL?12和IL?17等也參與了機體的免疫功能調節［7］，故本研究基于血清7種細胞因子的PLS?DA模型尚不能完全揭示MPP時患兒的免疫狀況，表現為PLS?DA圖中部分患兒分布與對照組兒童有重疊。此外，本研究中PLS?DA模型的R2Y和Q2均＞0.50，診斷和預測的準確率均較高（86.4%～90.0%），表明該模型較穩定、可靠且具有較高的診斷和預測能力；置換驗證圖中R2和Q2的截距均＜0.05，故PLS?DA模型也無過度擬合現象。

本研究中，基于血清7種細胞因子的PLS?DA模型較全面地揭示了MPP時患兒體內的免疫功能狀態，有助于MPP的輔助診斷和預測分析。盡管如此，MPP患兒的免疫功能狀態與患兒感染MP的時間、用藥劑量、種類和療效等密切相關。因此后續應增加樣本量及細胞因子種類，全面、深入研究MPP患兒不同時期的免疫狀況，為全面揭示MPP時患兒體內的免疫功能狀態、鑒別診斷和監測MPP患兒治療效果、調整用藥方案等提供幫助。

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