轉基因動物模型制作進展

孫甫+楊姣+吳文煥+王磊+田宇

摘 要：轉基因動物是應用實驗的方法將外源基因導入到早期的胚胎內，使之可以在動物染色體基因組內穩定的整合，并能遺傳給后代的一類動物。隨著轉基因技術以及分子遺傳學的發展，轉基因動物模型逐漸應用在醫學科學的各個領域。本文對轉基因動物模型的幾種常用建模方法做一綜述，探討各種不同的轉基因動物模型制作方法的優劣。最后以顯微注射法為例簡述制作轉基因動物的方法。

關鍵詞：轉基因；動物模型；顯微注射法

中圖分類號：R-332 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.01.014

文章編號：1006-1959（2018）01-0035-03

Development of Transgenic Animal Models

SUN Fu1，YANG Jiao2，WU Wen-huan2，WANG Lei1，TIAN Yu1

（1.First Affiliated Hospital of Xi'an Medical College，Xi'an 710077，Shaanxi，China；

2.Xi'an Medical College，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

Abstract：Transgenic animals are the experimental methods used to introduce exogenous genes into early embryos so that they can be stably integrated in the genome of animal genomes and can be passed on to offspring animals.With the development of transgenic technology and molecular genetics， transgenic animal models are gradually applied in various fields of medical science.This article reviews several commonly used modeling methods for transgenic animal models and discusses the advantages and disadvantages of various methods for making transgenic animal models. Finally，the microinjection method as an example to describe the method of making transgenic animals.

Key words：Transgene；Animal model；Microinjection

轉基因動物（transgenic animals）是指應用實驗的方法將外源基因導入到早期的胚胎內，使之可以在動物染色體基因組內穩定的整合，并能遺傳給后代的一類動物。轉基因動物所有的細胞均整合有外源基因，并具有將外源基因遺傳給子代的能力，若動物只有部分組織細胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動物，這類動物只有在整合了外源基因的“局部組織細胞”恰為生殖細胞時，才能將其攜帶的外源基因遺傳給子代。隨著遺傳操作技術的不斷發展，轉基因動物技術已經廣泛的應用于疾病發病機制、基因功能、藥物篩選、治療效果評價等多個方面的研究[1]。1980年Gordon等向單核胚胎的原核內注射純化的DNA從而制成了第一只轉基因小鼠。2年后Palmiter等將重組的大鼠生長激素基因注入小鼠的受精卵原核，從而制成了生長速度明顯增快的超級鼠[2]。1987年Capecdhi等根據同源重組的原理，實現了導入的外源基因的定點整合，亦稱之為基因打靶技術[3]。從此轉基因技術逐漸成熟并應用于生物學、醫學等多個領域。雖然目前轉基因動物模型的制作方法多種多樣，但是在實驗室應用中仍存在較多問題，各種不同的轉基因動物模型制作方法各存在其自身的優缺點。本文對目前實驗室應用較多的幾種轉基因動物模型制作方法逐一回顧，分析其中的優缺點，希望能夠找到一種目前應用最廣泛的制作轉基因動物模型的方法[4]。目前實驗室制作轉基因動物模型的方法根據外源基因導入的方法和對象的不同可以分為以下幾種：分別為顯微注射法、精子載體導入法、胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞）法、反轉錄病毒法、電脈沖法、等[5]，我們將在本文逐一介紹。

1顯微注射法

顯微注射法是目前最常用并且是實驗室應用最成熟的專基因動物模型制作方法，其大致的過程如下：首先，選取6～8 w齡的雌性小鼠，向其腹腔內注射血清促性腺激素（pregnant mare serum gonactotropin，PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（humar chorionic gonactotropin，HCG），促進排卵。然后將其與雄性小鼠1：1交配。交配成功的標志是在雌性小鼠的陰道口發現白色的陰道栓。次日上午，將確認有陰道栓的雌性小鼠用頸椎脫臼法剖殺，取出輸卵管，仔細沖洗后小心取出受精卵。受精卵中有兩個原核，分別來自精子和卵子，向雄性原核中注入DNA溶液。用結扎了輸精管的雄性小鼠與發情期的雌性小鼠交配，刺激雌性小鼠的子宮頸管，造成假孕雌性小鼠。將受精卵移植至交配第3 d的假孕鼠輸卵管中，使之正常發育，操作時注意，因為DNA注入可能造成損傷，因此許多受精卵在中途停止發育，因此建議在注射時采用雙側多受精卵移植的方法。在注射成功后，應用PCR法對導入的遺傳基因進行分析，挑選出外源性基因導入成功的小鼠進行飼養和繁殖[6]。endprint

顯微注射DNA的方法目前應用較多，是實驗室真正成熟并可以穩定生產轉基因動物的有效方法。但在其制作過程中仍涉及復雜的操作過程[7]。首先，在制作過程中要注意掌握母畜的性周期，使母畜在預先設定的時間內排卵，以保證獲得大量剛剛受精的單細胞胚胎。其次，此種方法制作的轉基因動物只能約占子代中的1%～3%，效率較低，但是結果相當穩定，并且成本較低，是目前實驗室常用的一種值得推薦的方法[8]。

2精子導入法

利用雄性精子作為外源性基因，借助受精作用把外源基因導入受精卵，整合到受精卵的基因組中的方法稱為精子導入法，是制作轉基因動物的一種新的方法。此方法把精子作適當處理后，使其具有攜帶外源基因的能力，然后用攜帶有外源基因的精子給母畜受精，在母畜的后代中就會產生一定比例的動物是整合了外源基因的動物。該法簡單、方便。與顯微注射法，其成本較低，同時不涉及對動物進行手術處理，因此其操作相對簡單[9-10]。但在實踐過程中仍然發現這種方法成功率較低，而且對于精子是否可作為外源DNA載體也存在爭論。因此目前這項技術仍處在早期探索階段，仍需進一步實驗室研究。應用此種方法可以將人工授精、體外受精與轉基因結合起來。

3胚胎干細胞法

胚胎干細胞（ES細胞）是指從囊胚期的內細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞，將其進行體外培養，擴增、轉化和制作遺傳突變型等遺傳操作。本法以整合有外源基因的ES細胞作為供體細胞，將注射過的胚胎經培養后篩選無發育缺陷的囊胚，移植到交配第3 d的假孕受體動物子宮內，培育出轉基因動物。這種辦法外源基因整合率較高，但是不易建立ES細胞系。并且在實驗過程中要通過嵌合體途徑，因此實驗周期比較長[11-12]。胚胎干細胞法外源基因的整合率較高，實驗者可以在植入囊胚前選擇合適轉化的ES細胞，避免了以前只能在子代篩選的缺點，并能充分利用分子生物學發展起來的各種先進方法，是一種目前實驗室很有前途的技術。但是它同樣存在缺點，比如不易建立ES細胞系。并且由于通過嵌合體途徑，所以實驗周期長。但是，仍是目前實驗室較有前景的一種轉基因動物模型制作方法。

4反轉錄病毒法

反轉錄病毒具有侵入宿主細胞并整合于細胞的染色體DNA的能力。將外源基因DNA插入反轉錄病毒載體，通過輔助細胞包裝成高感染度的病毒顆粒，感染胚胎后，將感染的桑椹期胚胎細胞導入子宮，可發育成攜帶外源基因的子代動物[13]。

該法整合率較高，目的基因不易破壞，多是單拷貝、單位點整合，適合于難以觀察到原核的禽類受精卵。由于病毒衣殼大小的限制，目的基因不宜超過10 kb，否則影響活性和穩定。此外，病毒DNA可能影響外源基因在宿主動物的表達[14]。

5電脈沖法

電脈沖法（electroporation）又稱電穿孔法，是將供體DNA與受體細胞充分混勻，在外界的高電壓短脈沖下改變細胞膜結構，使細胞膜產生瞬間可逆性電穿孔，從而使一定大小的DNA可以通過細胞膜進入細胞，運送到細胞核。目前在動物中電脈沖法主要用來轉化胚胎干細胞[15]。

以上方法是目前實驗室制作轉基因動物模型常用的幾種方法，各自有其優缺點，適用于不同的轉基因模型制作過程。我們以顯微注射法為例，簡述轉基因細胞的制作過程。用顯微注射法制作的第一代子鼠為嵌合體子鼠，因此并非子鼠全部細胞中均有導入的外源基因，為了得到純合子的轉基因小鼠，還需用產生的雄性小鼠與提供囊胚的雌性小鼠交配，也稱作回交[16]。回交后產生的子代小鼠有兩種，野生型與雜合體。將雜合體小鼠互交后產生的子代鼠中會有野生型，雜合體和純合體三種，通過PCR的方法可以將純合體挑選出來，再進行繁殖，這樣就能夠得到穩定的轉基因小鼠品系[17-18]。

轉基因動物技術是上世紀八十年代發展起來的一種高新生物技術，近年來得到了飛速發展，轉基因動物在生命科學研究中的重要性也越來越受到人們的重視。轉基因動物技術的核心，是把遺傳的功能單位─基因轉移到動物體內，使它成為動物體內的一部分。被轉移的基因可以來自同種或異種動物，也可以來自植物或微生物[19]。這樣一來，就打破了物種之間的界線，也可以說動物能與植物、微生物雜交了。目前，轉基因動物模型大部分局限于單個基因的轉移，隨著科學技術的發展，我們預料未來會出現多個基因的同時轉移，那么轉基因動物模型的應用范圍又將極大擴展。在轉基因動物方面，我國也取得了許多優秀的成果，目前已獲得了轉基因魚、兔、雞等多種轉基因動物[20-21]。雖然目前圍繞轉基因技術的應用仍然存在一些爭論，但是我們認為隨著科學技術的進一步發展，轉基因技術必將擁有更為廣泛的應用前景。

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收稿日期：2017-7-21；修回日期：2017-8-20

編輯/李樺endprint