分子印跡固相萃取- 高效液相色譜法測定牛奶中四環素類抗生素殘留

付珍珍，曾 月，李增威，何 利，周 康，劉書亮，鄒立扣，敖曉琳，陳姝娟

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014)

四環素類抗生素(tetracyclines，TCs)是一類由放線菌產生的廣譜抗生素，包括土霉素(oxytetracycline，OTC)、四環素(tetracycline，TC)，以及金霉素(chlortetracycline，CTC)等[1-2]，主要用于動物疾病的預防、治療和促進動物生長[3]。但由于使用不規范，也造成了TCs在動物性食品中的殘留[4-6]，給動物性食品安全帶來巨大隱患，人類若長期食入含有TCs殘留的食物易造成牙齒畸形、肝臟損害等。研究表明，抗生素進入動物體內后約70%不能被吸收，不吸收的部分大都以原形或代謝產物的形式排出，污染土壤[7]。據報道，在用動物排泄物施肥的土壤的0～40 cm表層，檢測到濃度高達32.3 mg·kg-1的土霉素和26.4 mg·kg-1的金霉素殘留[8]。目前，檢測TCs的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜- 質譜聯用法、酶聯免疫分析法和微生物法等[9-10]。其中，高效液相色譜法為實驗室最常用的方法。該方法成本較低，靈敏度較高，檢出限可低至μg·L-1級別，被認為是目前檢測TCs的首選方法[11]。

TCs以痕量存在于食品中，而食品基質組成復雜，因此需要通過有效的預處理方法來富集樣品中的TCs以便于后續檢測的進行[12]。預處理不當會引入新的干擾物質影響檢測的準確度。目前用于TCs預處理的方法主要有液- 液萃取、固相萃取[13-14]和基質輔助分散固相萃取[15]等，其中：液- 液萃取操作煩瑣，選擇性不高，且使用的溶劑對環境污染較大；基質輔助分散固相萃取法不易標準化，受操作者個體差異影響較大；固相萃取因其操作簡便、選擇性吸附較高、平衡時間短等優點，得到了廣泛應用。分子印跡技術(molecularly imprinted technology，MIT)是對目標物質進行特異性識別的一種新型技術[16-17]，具有特異性強、穩定性高和可重復使用的優點，在分離、催化劑和仿生傳感器等方面應用成效良好[18]。

本實驗運用MIT，將功能單體甲基丙烯酸(methacrylic acid，MAA)與模板分子鹽酸強力霉素(doxycycline hydrochloride，DC)，通過沉淀聚合制備出對TCs有特異性吸附的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)，并結合傳統固相萃取技術，將其作為填料用于樣品預處理，旨在促進MIT在動物性食品抗生素殘留檢測領域的應用發展，并為痕量物質的富集及檢測提供一定的實驗基礎與參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TGL- 16G型高速離心機、Nicolef is 10型紅外光譜儀，德國賽默飛世爾科技有限公司集團；HH數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；UV- 1800PC型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；SB- 5200DTDN型超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；ZMQS5V001型Milli- Q超純水系統，美國密理博公司；Waters 2487型高效液相色譜儀，美國Waters公司；DZF- 6050型真空干燥箱，上海三發科學儀器有限公司。

5個品牌的250 mL盒裝牛奶從市場購得；MAA、偶氮二異丁腈(AIBN)、乙腈、甲醇、乙酸、草酸，成都市科龍化工試劑廠；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，成都化夏化學試劑有限公司；乙腈、甲醇，色譜純，廣東光華科技股份有限公司；DC，純度95%～102%，成都化夏化學試劑有限公司；TC、OTC、CTC標準品，純度95%，上海瑞永生物科技有限公司。除有特別說明外，所有試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 四環素類分子印跡聚合物的制備

取0.15 mmol DC、1.80 mmol MAA和9.00 mmol EGDMA溶于30 mL乙腈- 丙酮(體積比16∶14)溶液，超聲5 min后加入12 mg AIBN，通氮氣除氧10 min，密封后于恒溫水浴箱中60 ℃反應24 h得到聚合物。用乙腈- 甲醇(體積比1∶1)溶液為洗液，在索氏提取器內洗脫48 h，再用甲醇- 水(體積比1∶1)洗去模板分子DC。洗脫完畢后于40 ℃真空干燥至質量恒定，得到MIPs。

采用同樣方法不加模板分子制備非印跡物(NIPs)。

1.2.2 四環素類分子印跡聚合物的表征

(1)紅外光譜。將樣品用KBr壓片法制成薄片，在500～4 000 cm-1范圍內測定MIPs、NIPs、MAA、DC，以及EGDMA的紅外光譜。

(2)掃描電鏡。用甲醇溶液分散MIPs并涂于載玻片上，對其噴金后用XL- 30ESEM型掃描電鏡觀察聚合物形態特征。

1.2.3 MIPs吸附特性研究

(1)HPLC檢測條件。色譜柱，Sepax HP- C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相，乙腈和0.01 mol·L-1草酸- 水(體積比8∶2)溶液；流速，1.0 mL·min-1；柱溫，30 ℃；進樣量，20 μL；檢測波長，355 nm。

(2)標準溶液配制。準確稱取10 mg TC(OTC、CTC)置于1 000 mL容量瓶，甲醇定容，配制濃度為10 μg·mL-1的TC(OTC、CTC)儲備液。再用甲醇分別稀釋為0.05、1.0、3.0、5.0、10.0 μg·mL-1的標準溶液系列待用[19]。

(3)MIPs對TC(OTC、CTC)的吸附動力學。分別稱取10 mg MIPs和NIPs于20 mL 0.1 μg·mL-1的TC(OTC、CTC)標準液。室溫下振蕩反應，分別于5、15、30、60、90、120 min后4 000 r·min-1離心10 min，用HPLC- UV測定上清液濃度[20]，依式(1)計算吸附量(Q，μg·mg-1)。

(1)

式(1)中：V為溶液的體積(mL)；m為MIPs(NIPs)的質量(mg)；c0為溶液初始濃度(μg·mL-1)；c1為吸附殘液濃度(μg·mL-1)。

(4)MIPs對TC(OTC、CTC)的靜態吸附。以甲醇為溶劑，將TC(OTC、CTC)儲備液配成濃度為0、0.05、0.1、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg·mL-1的標準液。分別加入2 mg MIPs，室溫下振蕩反應8 h，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液過濾后用HPLC- UV檢測，據式(1)計算吸附量。以同樣的方式對NIPs進行考查。

1.2.4 實際樣品分析

(1)MIPs固相萃取小柱制備。稱取MIPs 150 mg、硅藻土75 mg，填充3.0 mL固相萃取柱，用篩板將其壓緊并輕敲小柱，直至篩板與混合物緊密結合，然后用3.0 mL甲醇對MIPs固體柱進行活化。

(2)樣品分析。準確量取10.0 mL牛奶，加入10.0 mL溴化四丁基銨- 乙腈(物質的量之比為1∶3)提取溶液，渦旋5 min，高速離心后取上清液，下層殘渣重復提取2次。然后用20 mL乙腈除去提取液中的蛋白，再用20 mL正己烷除去脂質。50 ℃水浴蒸干后，用3 mL 0.5 mol·L-1KH2PO4溶液充分溶解后待用。以5.0 mL正己烷淋洗小柱后加入樣品溶液，再用5.0 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，最后用5.0 mL甲醇- 冰乙酸(體積比8∶2)溶液洗脫。收集洗脫液，氮氣吹干，用5.0 mL流動相溶解，過0.45 μm濾膜后進行HPLC- UV檢測。

2 結果與分析

2.1 合成條件優化

2.1.1 引發劑用量

AIBN受熱分解可產生引發聚合反應所需的自由基團[20]。由圖1可以看出，AIBN用量會影響MIPs的吸附量，隨著AIBN用量的增加，MIPs的生成量呈現先增加后減少的趨勢，吸附量也相應變化，但所合成的MIPs的鏈長逐漸縮短，結合圖1，確定AIBN最佳用量為15 mg。

2.1.2 溶劑選擇與用量

圖1 AIBN用量對MIPs吸附量的影響Fig.1 Influence of AIBN amount on MIPs adsorption quantity

溶劑作為聚合反應發生的場所，不僅其種類會對MIPs產生影響，使用量也會影響MIPs的合成。由圖2可看出：甲醇作為溶劑制備出的MIPs吸附量最低，這是由于甲醇極性太強，易破壞MAA與DC間的氫鍵；丙酮作為溶劑合成的MIPs吸附量最高，但合成速度太快，合成溫度難以控制，故須與其他溶劑配合使用；乙腈作為溶劑合成的吸附性能較為穩定，對環境的耐受力大，但吸附量不夠理想。將乙腈與丙酮按一定比例混合可克服各自缺點，發揮各自優點，使MIPs達到最好的吸附效果。

設計丙酮與乙腈不同體積比(10∶20，14∶16，15∶15，16∶14，20∶10)的單因素實驗，來確定其最佳使用方案。結果表明，當乙腈與丙酮以16∶14的體積比混合作為溶劑時，合成的MIPs吸附量最大，且合成速度合理，條件易控制，故選用此體積比的乙腈- 丙酮混合溶液作為溶劑。

溶劑用量對MIPs生成量的影響如表1所示，用量過低，無法發生聚合反應生成MIPs，用量過高對反應體系起稀釋作用，降低聚合物的生成量。故選擇30 mL作為溶劑最佳用量。

2.1.3 模板分子/單體/交聯劑比例

圖2 溶劑對MIPs吸附量的影響Fig.2 Influence of solvent on MIPs adsorption quantity

表1溶劑用量對MIPs生成量的影響

Table1Influence of solvent dosage on MIPs quantity

溶劑用量Solventdosage/mLMIP生成量MIPquantity/mg1002025305540305020

研究表明，模板與單體的比例(即二者物質的量之比)可對聚合物的吸附性能產生影響。比例太低難以形成完整的模板識別位置，無法實現單體與模板分子的多點結合，反之比例太高則單體過剩，會導致非特異性吸附增強[21]。本實驗使用0.15 mmol DC，并保持MAA與EGDMA物質的量1∶5的比例不變，考查MAA用量對MIPs形態和合成量的影響(DC、MAA、EGDMA的物質的量之比分別為1∶1∶5、1∶4∶20、1∶6∶30、1∶8∶40、1∶10∶50、1∶12∶60、1∶14∶70)。結果表明，MIPs的聚合程度與MAA用量成正比，但隨MIPs聚合程度加深，其形狀由規則的球狀團聚物變為不規則的團聚物，進而導致吸附量下降，因此選擇DC、MAA、EGDMA物質的量之比1∶12∶60為最佳比例。

2.2 聚合物表征

2.2.1 紅外光譜分析

圖3為MIPs、MAA、EGDMA的紅外光譜圖，在1 602 cm-1位置，MIPs相比MAA、EGDMA振動幅度明顯降低，有對應于C=C雙鍵伸縮振動的弱紅外吸收峰，表明此處MAA和EGDMA成功交聯。在3 300 cm-1羥基的特征峰[22]發生明顯振動，表明MIPs含有羥基，能與目標化合物通過氫鍵結合。

由圖4可知，洗脫后的MIPs在2 400 cm-1和820 cm-1處較洗脫前的MIPs伸縮振動明顯減小，分別為DC中芳烴C—H和N—H的特征峰，表明DC與EGDMA成功交聯。洗脫后的MIPs與NIPs的紅外譜圖基本重合，因二者具有相同的化學組成與骨架結構，且NIPs中不含DC，表明MIPs中的DC已被完全洗脫。

1，MIPs；2，MAA；3，EGDMA.圖3 MIPs、MAA與EGDMA的紅外光譜圖Fig.3 FT- IR spectra of MIPs、MAA and EGDMA

1，洗脫前MIPs；2，洗脫后MIPs；3，NIPs。1， MIPs before elution; 2， MIPs after elution; 3， NIPs.圖4 MIPs洗脫前后與NIPs的紅外光譜圖Fig.4 FT- IR spectra of MIPs before and after elution and NIPs

2.2.2 掃描電鏡分析

電鏡掃描結果如圖5所示。MIPs表面光滑，呈團聚球狀，由于與DC發生了聚合反應，表面形成與DC互補的孔穴，可有效地用于特異性識別DC。

2.2.3 吸附試驗

在靜態吸附實驗中，MIPs表面孔穴的數量及互補度對吸附效果具有決定性的作用[22]。從圖6可知，MIPs對OTC的吸附量較TC大，原因是MIPs表面的孔穴與OTC的互補度較大，吸附量也更大。吸附動力學結果如圖7所示，MIPs對TC(OTC、CTC)的吸附速度初期均較后期快，可能是因為吸附初期MIPs表面的孔穴與TC(OTC、CTC)進行特異性結合導致表面的孔穴被堵塞，之后TC(OTC、CTC)滲入MIPs內部需要的時間更長。NIPs與MIPs相比吸附量更低，原因是NIPs未與DC發生聚合，沒有形成與TC(OTC、CTC)互補的孔穴，因此沒有特異性吸附[23]。

圖5 MIPs的電鏡掃描圖Fig.5 SEM images of MIPs

圖6 MIPs對四環素、土霉素和金霉素的靜態吸附曲線Fig.6 Static sorption of TC， OTC and CTC on MIPs

圖7 MIPs對四環素、土霉素和金霉素的動態吸附曲線Fig.7 Sorption kinetics of TC， OTC and CTC on MIPs

2.3 方法性能評價

2.3.1 線性范圍、檢出限和相對標準偏差

圖8為DC、TC、OTC和CTC混合標準工作液的色譜圖，初始濃度均為0.05 mg·mL-1。在1.2.3節HPLC檢測條件下重復測定標準液3次，以峰面積為縱坐標，標準液濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果如表2所示，在0.05～10.0 μg·mL-1范圍內TC、OTC和CTC的濃度與吸附量呈線性關系，相關系數(R2)大于0.999 2。最低檢出限和定量限分別按3倍信噪比和10倍信噪比計算，TC和OTC的檢出限為0.02 μg·mL-1，定量限為0.10 μg·mL-1，CTC的檢出限為0.05 μg·mL-1，定量限為0.25 μg·mL-1。此結果比現有研究報道中采用HPLC法測定TC、OTC和CTC的檢出限低[24-26]，相對標準偏差小于3.80%(n=3)。綜上，本實驗方法具有較寬的線性范圍、較高的靈敏度，以及良好的重現性。

2.3.2 加標回收實驗

利用本研究建立的方法測定不含TCs的牛奶樣品中添加混合標準溶液后TCs的回收率。根據線性范圍內最低濃度的1、2、10、20倍進行加標。表3為在空白牛奶中分別加入0.05、0.1、0.5、1.0 μg·mL-1的TC、OTC、CTC，按照1.2.4節方法處理，在1.2.3節檢測條件下，重復合成產物5次后的檢測結果。結果顯示，MIPs對TC、OTC和CTC的平均加標回收率分別為82.0%～86.3%、82.0%～86.0%和79.4%～85.4%，對于中低濃度的加標水平回收率較高，高濃度加標水平的平均回收率與目前最新研究結果持平[27]，說明本實驗方法具有較高的準確性。

圖8 DC(A)、TC(B)、OTC(C)和CTC(D)高效液相色譜圖Fig.8 Chromatograms of DC(A)， TC(B)， OTC(C) and CTC(D)

表2四環素、土霉素和金霉素的標準曲線

Table2Standard curves of TC， OTC and CTC

指標IndexTCOTCCTC線性范圍Linearrange/(μg·mL-1)0.05～10.00.05～10.00.05～10.0線性方程Linearequationy=6422711.61x-21914.63y=20518470.29x-86811.56y=34563477.11x-101084.81相關系數Correlationcoefficient0.99920.99920.9995檢出限Detectionlimit/(μg·mL-1)0.020.020.05相對標準偏差Relativestandarddeviation(n=3)/%2.903.203.80

表3TC、OTC和CTC的加標回收結果

Table3Recoveries of TC， OTC and CTC

TCs添加水平Inclusionlevel/(μg·mL-1)回收率Recoveryrate/%12345平均值MeanTC0.0581.083.082.582.281.582.00.184.183.382.081.482.182.60.583.085.084.582.283.583.61.085.088.086.085.586.886.3OTC0.0582.681.080.283.084.282.20.181.480.283.082.483.482.00.581.385.085.782.183.083.41.085.887.085.586.085.886.0CTC0.0580.680.078.279.080.279.60.178.479.279.082.479.379.70.580.180.279.778.478.679.41.085.584.886.084.586.085.4

2.4 實際樣品檢測

選取5個品牌的市售牛奶，每個品牌分別進樣3次，編號依次設定為1- 1，1- 2，1- 3，2- 1，…，5- 3。按1.2.4節方法處理，在1.2.3節所述條件檢測。結果如表4所示，2個品牌檢出TC，殘留量分別為0.04、0.02 μg·mL-1，1個品牌檢出OTC，0.03 μg·mL-1，均未超過我國農業部235號公告規定的TCs在牛奶中殘留的最大限量100 μg·kg-1。

為比較MIPs固相萃取柱和傳統固相萃取柱的萃取效果，分別用二者對樣品進行處理。在空白牛奶中添加適量的TC、OTC和CTC標準液，將其分為等量的2份(A和B)，A組按1.2.4節方法進行處理，B組用傳統型的NIPs固體柱處理，于1.2.3節條件下進行檢測。如圖9所示，經MIPs- SPE處理的牛奶樣品的TC、OTC和CTC峰面積響應值均比通過NIPs- SPE處理的樣品峰面積響應值高2.4倍左右，表明MIPs- SPE能特異性地吸附牛奶中的TC、OTC和CTC，提高了檢測的靈敏度及結果的準確度、精確度，有望用于土壤、動物源食品和水體等背景復雜樣品的檢測。而傳統固相萃取柱對TCs的特異性吸附不及MIPs高，可能會將異源物質富集在所需樣品中，且樣品中存在的雜質會影響固相萃取柱對目標物的富集能力，所以傳統固相萃取柱的萃取效果不及MIPs固相萃取柱。

表4牛奶樣品檢測結果

Table4Detection result of TCs in milk

μg·mL-1

ND，未檢出。

ND， Not detected.

3 小結

本文系統論述了MIPs的制備、表征，以及在實際樣品中的應用。實驗表明，以30 mL乙腈- 丙酮混合溶液(體積比16∶14)作為溶劑，0.15 mmol DC為模板分子，以DC/MAA/EGDMA=1∶12∶60的比例與15 mg AIBN進行沉淀聚合，得到的MIPs

圖9 不同萃取柱預處理后TCs的色譜圖Fig.9 Chromatogram of TCs pretreated with different extraction column

呈規則團聚球狀，且表面為蜂窩式孔狀結構。吸附特性研究表明：在0.05～10.0 μg·mL-1范圍內，TC、OTC和CTC的濃度與吸附量呈良好的線性關系，TC和OTC的檢出限為0.02 μg·mL-1，CTC的檢出限為0.05 μg·mL-1，相對標準偏差均小于3.80%。TC、OTC和CTC的平均加標回收率分別為82.0%～86.3%、82.0%～86.0%和79.4%～85.4%。將MIPs應用于復雜樣品中TCs的富集，具有特異性強、操作簡便的優勢，可作為一種高效的TCs檢測的預處理方法，用于動物源食品中低濃度TCs殘留檢測。

[1] 邱旭， 張健玲， 黃慧賢，等. 超高效液相色譜- 串聯質譜法測定凍烤鰻中4種四環素類藥物殘留[J]. 福建分析測試， 2016， 25(1):46-50.

QIU X， ZHANG J L， HUANG H X， et al. Determination of 4 tetracyclines residues in frozen roasted eel tissue by UPLC- MS/MS[J].FujianAnalysis&Testing， 2016， 25(1): 46-50. (in Chinese with English abstract)

[2] 賀德春， 許振成， 吳根義. 四環素類抗生素的環境行為研究進展[J]. 動物醫學進展， 2011， 32(4): 98-102.

HE D C， XU Z C， WU G Y. Progress on residues and environmental behaivor of tetracycline antibiotics[J].ProgressinVeterinaryMedicine， 2011， 32(4): 98-102. (in Chinese with English abstract)

[3] 孫霞， 王相友. 免疫傳感器在牛奶抗生素殘留檢測中的研究進展[J]. 食品科學， 2010， 34(10): 180-183.

SUN X， WANG X Y. Research progress in detection of antibiotic residues in milk by immunosensor[J].FoodScience， 2010， 34(10): 180-183. (in Chinese with English abstract)

[4] 王萍， 司雄元， 檀華蓉， 等. 6- 氨基青霉素烷酸分子印跡固相萃取柱在牛乳青霉素藥物檢測中的應用[J]. 食品與發酵工業， 2016， 42(4): 183-188.

WANG P， SI X Y， TAN H R， et al. Application of 6- APA molecular imprinted solid- phase extraction column in the detection of penicillins in milk[J].FoodandFermentationIndustries， 2016， 42(4): 183-188. (in Chinese with English abstract)

[5] 國占寶， 武玉香， 田文禮， 等. 食品中四環素類殘留的酶聯免疫檢測試劑盒的研制[J]. 食品科學， 2011， 32(2): 333-337.

GUO Z B， WU Y X， TIAN W L， et al. Development of a new ELISA kit for tetracycline residue detection in foods[J].FoodScience， 2011， 32(2): 333-337. (in Chinese with English abstract)

[6] CHEE- SANFORD J C， MACKIE R I， KOIKE S， et al. Fate and transport of antibiotic residues and antibiotic resistance genes following land application of manure waste[J].JournalofEnvironmentalQuality， 2009， 38(3): 1086-1108.

[7] 張浩， 羅義， 周啟星. 四環素類抗生素生態毒性研究進展[J]. 農業環境科學學報， 2008， 27(2): 407-413.

ZHANG H， LUO Y， ZHOU Q X， Research advancement of eco- toxicity of tetracycline antibiotics[J].JournalofAgro-EnvironmentScience， 2008， 27(2): 407-413. (in Chinese with English abstract)

[8] 羅侃， 孫潤泰， 孫曉紅， 等. 牛奶中四環素類抗生素殘留量測定及市場調查[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2006， 16(9): 1077-1078.

LUO K， SUN R T， SUN X H， et al. Determination of tetracycline antibiotics residues in milk and market investigation[J].ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology， 2006， 16(9): 1077-1078. (in Chinese)

[9] 楊旭， 劉美嬌， 林深， 等. 限進材料固相萃取- 高效液相色譜在線聯用檢測牛奶中四環素類抗生素殘留[J]. 分析化學， 2016， 44(1): 146-151.

YANG X， LIU M J， LIN S， et al. Determination of tetracycline residues in milk by on- line coupling of restricted access material solid phase extraction with high performance liquid chromatography[J].ChineseJournalofAnalyticalChemistry， 2016， 44(1): 146-151. (in Chinese with English abstract)

[10] 閆小峰. 四環素類抗生素殘留檢測方法研究進展[J]. 中國獸藥雜志， 2010， 44(5): 47-50.

YAN X F. Research progress of determination methods for tetracyclines antibiotic residues[J].ChineseJournalofVeterinaryDrug， 2010， 44(5): 47-50. (in Chinese with English abstract)

[11] 楊曉芳， 楊濤， 王瑩， 等. 四環素類抗生素污染現狀及其環境行為研究進展[J]. 環境工程， 2014， 32(2): 123-127.

YANG X F， YANG T， WANG Y， et al. Research progress in pollution status and environmental behavior of tetracycline antibiotics[J].EnvironmentalEngineering， 2014， 32(2): 123-127. (in Chinese with English abstract)

[12] SONG J， ZHANG Z H， ZHANG Y Q， et al. Ionic liquid dispersive liquid- liquid microextraction combined with high performance liquid chromatography for determination of tetracycline drugs in eggs[J].AnalyticalMethods， 2014， 6(16): 6459-6463.

[13] CARO E， MARCE R M， CORMAC P， et al. Synthesis and appLication of an oxytetracyc line imprinted polymer for the solid- phase extraction of tetracycline antibiotics[J].AnaiyticaChimicaActa， 2005(1): 81-86.

[14] 張元， 張峰，周昱， 等.食品中四環素類藥物殘留檢測前處理及分析方法研究進展[J]. 藥物分析雜志， 2016， 36(4): 565-571.

ZHANG Y， ZHANG F， ZHOU Y， et al. Research progress on pretreatment techniques and determination methods of tetracyclines residues in food[J].ChineseJournalofPharmaceuticalAnalysis， 2016， 36(4): 565-571. (in Chinese with English abstract)

[16] 張成波， 李兆周， 侯玉澤， 等. 分子印跡技術在藥物殘留檢測中的應用[J]. 食品科學， 2014， 35(9): 323-328.

ZHANG C B， LI Z Z, HOU Y Z， et al. Application of molecular imprinting technology in the detection of drug residues[J].FoodScience， 2014， 35(9): 323-328. (in Chinese with English abstract)

[17] YU H， MU H， HU Y M. Determination of fluoroquinolones ulfonamides and tetracyclines multiresidues simultaneously inporcine tissue by MSPD and HPLC- DAD[J].JournalofPharmaceuticalAnalysis， 2012， 2(1): 76-82.

[18] 黃曉麗， 蒲家志， 陳襯心， 等. 分子印跡技術在藥學中的發展及其應用前景[J]. 安徽農業科學， 2016 (3): 3-6.

HUANG X L， PU J Z， CHEN C X， et al. Application of molecular imprinting technique in pharmaceutical science and its prospect[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences， 2016 (3): 3-6. (in Chinese with English abstract)

[19] SUN X， HE X， ZHANG Y， et al. Determination of tetracyclines in food samples by molecularly imprinted monolithic column coupling with high performance liquid chromatography[J].Talanta， 2009， 79(3): 926-934.

[20] 李倩. 四環素類分子印跡聚合物的合成及其識別性能的研究[D]. 上海: 中國農業科學院， 2010.

LI Q. The synthesis of tetracycline molecular imprinted polymer and the evaluation of their recognition characters[D]. Shanghai: Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2010. (in Chinese with English abstract)

[21] 蔣宇翔， 龐道林， 何強， 等. 分子印跡技術特異性識別頭孢類分子的光譜研究[J]. 光譜學與光譜分析， 2011， 31(7): 1852-1856.

JIANG Y X， PANG D L， HE Q， et al. Spectroscopy study on the selectively distinguishing cefalexin with the molecular imprinted polymer[J].SpectroscopyandSpectralAnalysis， 2011， 31(7): 1852-1856. (in Chinese with English abstract)

[22] SANCHEZ- POLO M， VELO- GALA I， JESUS J. Molecular imprinted polymer to remove tetracycline from aqueous solutions[J].MicroporousandMesoporousMaterials， 2015， 203: 32-40.

[23] DIVYA M P， YUDHISHTHIR S R， RAJAN S. Synthesis and application of tetracycLine imprinted polymer[J].AnalyticalLetters， 2010， 43(6): 919-928.

[24] 莊園， 彭英， 趙永剛， 等. 分子印跡固相微萃取- 高效液相色譜法測定水和牛奶中三種四環素類藥物[J]. 分析科學學報， 2014， 30(4): 451-456.

ZHUANG Y， PENG Y， ZHAO Y G， et al. Determination of tetracyclines in water and milk by solid phase microextraction based on tetracylines molecularly imprinted polymers coupled with HPLC[J]. JournalofAnalyticalScience， 2014， 30(4): 451-456. (in Chinese with English abstract)

[25] 蔡志斌， 張英， 劉麗. 固相萃取- 高效液相色譜法同時測定牛奶中3種四環素類抗生素殘留量[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2007， 17(2): 270-272.

CAI Z B， ZHANG Y， LIU L. Determination of 3 kinds of tetracyclines residues in m ilk by SPE- HPLC[J].ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology， 2007， 17(2): 270-272. (in Chinese with English abstract)

[26] 陳小燕， 牛玉玲， 朱敏， 等. 固相萃取- 高效液相色譜法測定牛奶中四環素類抗生素[J]. 中國抗生素雜志， 2017， 42(2): 129-133.

CHEN X Y， NIU Y L， ZHU M， et al. Determination of tetracycline antibiotics in milk by solid phase extraction combined with high performance liquid chromatography[J].ChineseJournalofAntibiotics， 2017， 42(2): 129-133. (in Chinese with English abstract)

[27] 王雅群， 潘道東. 磁性分子印跡固相萃取食品中的四環素類抗生素殘留[J]. 食品工業科技， 2015， 36(18): 53-58.

WANG Y Q， PAN D D. Magnetic molecularly imprinted nanocompsites combined with solid phase extraction detect tetracycline antibiotic residues[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry， 2015， 36(18): 53-58. (in Chinese with English abstract)