曝氣量對顆粒污泥制備生物柴油的影響

遲 夏,李安婕,李美茜 (北京師范大學環境學院,水沙科學教育部重點實驗室,水環境模擬國家重點實驗室 北京 100875)

生物柴油是一種可再生,環境友好型能源,與動植物油脂相比,微生物油脂生產周期短,占用土地量小,可利用大量有機廢棄物,是降低生物柴油生產成本,避免“與人爭糧,與糧爭地”的重要途徑之一.利用廢水作為碳源生產微生物油脂不僅可以降低生產成本,還可以減少因廢水排放造成的環境污染.此外,把剩余污泥作為可再生資源實現能源回收,不僅能滿足嚴格的環境質量標準,還能持續提供可靠能源.近幾年已有研究者開展了市政廢水處理廠初沉池,二沉池活性污泥生產生物柴油的方法,含量以及組分的研究[1-3],但目前活性污泥中提取出的脂質相對純菌培養較低,為了提高活性污泥提取油脂制備生物柴油的可行性,需要從提高活性污泥微生物產油能力入手.

好氧顆粒污泥是多種微生物在生存競爭過程中自發形成的一種代謝互補緊密的營養關系,具有相當豐富的微生物相,通過調整好氧顆粒污泥培養條件很可能可以提高顆粒污泥混合菌群中產油微生物的比重以及油脂產量.顆粒污泥結構致密且生物量大,有利于簡化后續微生物油脂提取脫水步驟以及提高油脂產量,從而降低生物柴油生產成本.

曝氣量是污水好氧生化處理系統的重要工藝參數之一,影響著活性污泥中微生物的菌群結構以及降解污染物效果[4].此外,曝氣系統也是污水處理廠運行的主要能耗單元之一.已有研究表明曝氣量及溶解氧對微生物脂肪酸的組成會產生影響[5],因此,從節能降耗的角度出發,研究曝氣量對顆粒污泥菌群結構、油脂積累以及后續制備生物柴油產量及組分的影響,對于顆粒污泥制備生物柴油的工業化生產具有理論價值和實踐意義.

1 材料與方法

1.1 實驗裝置和SBR運行

以3個工作體積為1.2L的有機玻璃柱(直徑5cm,高60cm)作為SBR反應器,分別設置不同的曝氣量(R1,42L/(min·m3);R2,167L/(min·m3);R3,667L/(min·m3)).在反應器底部和中部分別設進水口和排水口.進水COD濃度為2000mg/L, COD:N:P=100:2:1,分別以葡萄糖和氯化銨作為碳源和氮源.反應器每6h為一個周期,其中進水5min,曝氣344min,沉淀 3min,出水8min.在運行期間,通過投加NaHCO3,控制反應器的pH值處于7.5～8之間.接種顆粒污泥濃度約為6.4g/L左右.運行期間,測試的指標包括葡萄糖和氨氮濃度,污泥生物量,污泥粒徑,污泥容積指數,以反映污泥的變化.

1.2 顆粒污泥分析檢測方法

出水葡萄糖濃度采用苯酚-硫酸法測定[6],氨氮濃度采用國標《水質氨氮的測定納氏試劑分光光度法》[7]測定.污泥平均粒徑由激光粒度分析儀(Microtrac S3500,U.S.)測試.污泥特性監測指標包括總懸浮固體濃度 MLSS和污泥溶劑指數SVI[8].污泥中微生物菌群分布采用高通量測序獲得,細菌與真菌的分布比例采用熒光定量PCR分析.選用E.Z.N.A.? Bacteria DNA試劑盒(Omega Bio-Tek, Norcross, GA, U.S.),根據試劑盒說明提取微生物DNA,并分別對細菌16s的V3V4區,真菌18s rRNA 進行PCR擴增,引物為16S Eub338 (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)/Eub518 (ATTACCGCGGCTGCTGG)和18S-F(CGGCTACCACATCCAAGGAA)/18S-R(GCTGGAATTACCGCGGCT).擴增程序如下:95℃變性2min,然后在95℃變性30s,55℃復性30s,72℃延伸30s,循環25次,72℃終延伸5min.20μL 標準PCR反應體系:5×Fastpfu Buffer 4μL,2.5mM dNTPs 2μL,上下游引物(5mM)各0.8μL,Fastpfu聚合酶0.4μL,DNA模板10ng.每個樣本3次重復,將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen Biosciences, Union City, CA, U.S.),將PCR產物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(Promega, U.S.)進行檢測定量.純化后的擴增產物由上海美吉生物醫藥科技有限公司在Illumina MiSeq PE300 平臺上進行測序[9].

1.3 生物柴油制備和分析方法

生物柴油的制備方法:將1g 脫水污泥,7.5mL 5%硫酸甲醇及10mL正己烷在75℃條件下甲酯化反應7h,使用5mL飽和氯化鈉溶液將錐形瓶中的混合物轉移至離心管,并用正己烷重復萃取3次,離心后提取上層正己烷層,在80℃條件下蒸干,獲得生物柴油.生物柴油在進行氣相色譜檢測前,存于-20℃冰箱.加入適量正己烷充分溶解樣品,并以1,3-二甲苯作為內標,采用0.45μm的聚四氟乙烯(PTFE)濾膜過濾,利用安捷倫7890A氣相色譜儀進行分析.色譜柱為30m×0.320mm×0.25μm HP-5毛細管柱(19091J-413,Agilent),其固定相為5%苯基甲基聚硅氧烷.柱箱溫度從50℃開始,保持2min,以10℃/min的速率提高到130℃,以4℃/min提高到200℃,以3℃/min升至220℃,最后以5℃/min升至270℃.氫氣,空氣和氮氣的流量分別是30,300和25mL/min.進樣量為1μL,不分流模式.進樣口和FID檢測器溫度分別設為200℃和270℃.用于脂肪酸甲酯定性定量分析的標準物包括含14種C8～C24的FAME混標(18918-1AMP,Sigma-Aldrich,美國),兩種支鏈脂肪酸甲酯(12-甲基十四烷酸甲酯,14-甲基十五烷酸甲酯,Larodan Fine Chemicals AB,瑞典)和兩種奇數碳脂肪酸甲酯(十五烷酸甲酯,十七烷酸甲酯,AccuStandard, Inc.,紐黑文,美國).

2 結果與討論

2.1 曝氣量對SBR運行情況的影響

曝氣量分別為42,167和667L/(min·m3)的條件下,SBR反應器中的溶解氧濃度在一個運行周期內雖然會發生變化,但基本保持在3個不同水平,曝氣量較高的反應器內能長時間保持較高的溶解氧濃度(圖1).進水完成后,R1反應器中的溶解氧略低,為4mg/L,R2和R3的溶解氧濃度為4.4mg/L.曝氣量為42L/(min·m3)時,反應器中的溶解氧在1h內下降到2mg/L左右,之后有輕微下降趨勢,并在第4h降為1.6mg/L,緊接著開始略有上升.R2中的溶解氧在進水1h后,下降到3.7mg/L,之后呈逐漸上升的趨勢,在曝氣結束時達到6.4mg/L.曝氣量為667L/(min·m3)時,R3的溶解氧濃度在前2h迅速上升到8.7mg/L;后4h,R3的溶解氧雖然略有波動,但幾乎都在8mg/L以上.反應器中溶解氧的回升表明顆粒污泥對葡萄糖和氨氮的降解接近完成,減少耗氧量,使得反應器中的溶氧濃度增加.

曝氣量不同,不僅反應器中的溶解氧濃度不同,顆粒污泥受到的剪切力也不同,因此顆粒污泥的生物量,沉降性能,平均粒徑均呈現出明顯差異(圖2).曝氣量為42L/(min·m3)時,顆粒污泥的生物量在第一周內幾乎不變,微生物生長和衰亡的速率相當;曝氣量為167 和667L/(min·m3)時,生物量有明顯上升,說明提高曝氣量有助于微生物的生長.但在后兩周.

反應器R1和R2出現了生物量流失,MLSS逐漸下降.這是由于顆粒污泥粒徑較大,曝氣量低時,所提供的剪切力不利于顆粒污泥結構穩定;并且曝氣量較低時,反應器中的溶解氧濃度也較低,在高有機負荷條件下,容易出現污泥膨脹.污泥發生膨脹后,有許多來不及沉降的污泥隨出水流出,使得反應器中的MLSS下降.

圖1 不同曝氣量下的SBR反應器溶解氧濃度Fig.1 The DO concentration in the three SBRs with different aeration rates

圖2b的結果也表明,曝氣量為42和167L/(min·m3)時,顆粒污泥的SVI值明顯升高(大于150mL/g),污泥沉降性能惡化.污泥發生膨脹時,顆粒污泥不再保持緊密結實的結構,反而變得蓬松,如圖2c所示,曝氣量為42和167L/(min·m3)的污泥粒徑明顯增加,而曝氣量為667L/(min·m3)下的污泥粒徑維持在570～730um范圍內,變化不大.當曝氣量為667L/(min·m3)時,反應器中的溶解氧充足,并且微生物和底物的接觸更為均勻,顆粒污泥處于較穩定的狀態.在第14d時,R3反應器中的MLSS達到(17.74 ± 0.16)g/L.并保持很好的沉降性能,其SVI在35mL/g以下.顆粒污泥的粒徑在前兩周逐步上升,第三周有所下降,這可能是由于生物量太高時,污泥負荷降低,引起顆粒污泥輕微解體.雖然曝氣量對顆粒污泥的生長和性狀有很大影響,但它們對葡萄糖均有很好的降解效果.曝氣量為42L/(min·m3)時,顆粒污泥對氨氮的降解效果不如曝氣量較高時的情況,剩余氨氮約為5mg/L.當曝氣量較高時,剩余氨氮低于1mg/L.

觀察污泥的形態特征,發現顆粒污泥在較低曝氣量下運行時,形態發生了顯著的改變(圖3).當曝氣量為42和167L/(min·m3)時,污泥的顏色從初始的黃色變成灰白色,在邊界上出現絨毛狀微生物.第14d時,由于較小的絮狀物更容易被排出,反應器中留下的多是連接成片狀的污泥或是被灰白色微生物包裹的顆粒污泥.雖然有許多絲狀菌附在顆粒污泥的表面,但膨脹后顆粒污泥內部黃色的區域仍然易于辨認.當曝氣量為667L/ (min·m3)時,顆粒污泥除了在數量上明顯增多外,在外觀上與接種顆粒污泥無明顯差別,均保持密實的結構,而且顆粒污泥呈黃色,并無明顯膨脹的現象.

圖2 曝氣量對SBR反應器中顆粒污泥生物量、沉降性能和平均粒徑的影響Fig.2 The performance parameters of the three SBRs:MLSS of the granular sludge, SVI of the granular sludge, sedimentation and particle size of sludge

2.2 曝氣量對顆粒污泥制備生物柴油產量及組分的影響

在曝氣量分別為42,167和667L/(min·m3)的條件下運行20d后,顆粒污泥制備生物柴油的產量有了不同程度的提高,分別為(38.39±1.26),(48.62±1.36)和(27.28±2.94)mg/g SS,初始接種污泥的生物柴油產量為(22.71±2.24)mg/g SS,其中曝氣量為167L/(min·m3)條件下單位生物量的油脂含量最高.在667L/(min·m3)條件下,顆粒污泥的生長量最高,降低了污泥負荷,使得相應的生物柴油產量的增幅較低.

另一方面,不同曝氣量對顆粒污泥制備生物柴油各組分的影響極為明顯(圖3).如圖a所示,曝氣量為42,167和667L/(min·m3)時,棕櫚油酸甲酯(C16:1)的產量隨曝氣量的降低而升高,分別為(10.98 ± 0.22),(4.13 ± 0.46)和(1.70 ± 0.17) mg/g SS.曝氣量為667L/(min·m3)時,棕櫚酸甲脂(C16:0)的產量也明顯低于曝氣量為42和167L/(min·m3)的情況.但油酸甲酯(C18:1)的產量隨曝氣量的變化表現出相反的趨勢,隨著曝氣量的提高,其產量分別為(9.72±0.34),(12.16±0.36)和(14.79±1.35)mg/g SS.此外,亞油酸甲酯(C18:2)也受曝氣量影響很大,在曝氣量為167L/(min·m3)時,產量高達(20.85±0.09) mg/g SS.但曝氣量在42和667L/(min·m3)時,其產量明顯偏低,分別為(4.05±0.38)和(0.82±0.04)mg/g SS.上述結果表明適當的曝氣有利于某些特定脂肪酸的累積.比較生物柴油的組分分布發現,在曝氣量為667L/(min·m3)的條件下,顆粒污泥制備生物柴油的組分分布與接種污泥極其相近.這是由于接種污泥是在曝氣量為833L/(min·m3)的條件下培養而得的,本次實驗所設的667L/(min·m3)與之非常接近.而曝氣量為42和167L/(min·m3)時,生物柴油的組分分布卻差異很大.王怡等[10]采用某污水處理廠的二沉池污泥制備生物柴油,產量為19.3mg/g SS,主要包括棕櫚油酸甲酯,棕櫚酸甲酯,油酸甲酯,硬脂酸甲酯和亞油酸甲酯.其生物柴油產量與本實驗初始接種污泥的產量相近,遠低于在曝氣量167L/ (min·m3)下培養的顆粒污泥,說明適當的曝氣條件確實能夠提高生物柴油產量且影響生物柴油組分.

2.3 曝氣量對顆粒污泥菌群結構的影響

在不同曝氣量條件下運行一段時間后,顆粒污泥的菌群結構變化明顯.通過熒光定量PCR確定了顆粒污泥中細菌和真菌的比例(表1).3個反應器中細菌均占據著絕對優勢,比例在91%以上.曝氣量為42和667L/(min·m3)時,真菌的比例分別是0.01% 和0.18%;曝氣量為167L/(min·m3)時,真菌比例最高(8.57%).曝氣量為167L/(min·m3)時,顆粒污泥發生膨脹,部分生物量流失,使得污泥負荷增加(約1kg COD/kg MLSS?d).本實驗室之前的研究表明,初始污泥負荷較高時,真菌更容易成為顆粒污泥中的優勢菌群.類似地,本研究后期污泥負荷的提高,也可能促進真菌的繁殖.顆粒污泥在曝氣量為42L/(min·m3)條件下運行時,雖然污泥負荷有所提高,但過低的曝氣量可能影響微生物的活性,進而抑制了真菌的生長.真菌的產油能力一般高于細菌[11],因此曝氣量為167L/(min·m3)時,單位污泥的生物柴油產量最高(圖4).

圖3 不同曝氣量下SBR反應器中的顆粒污泥形態Fig.3 The morphology of the granular sludge in the three SBRs with different aeration rates

表1 顆粒污泥中細菌和真菌的比例Table 1 The distribution of bacteria and fungi in the three types of granular sludge

圖4 SBR反應器顆粒污泥制備生物柴油的產量和組分分布Fig.4 The yield of each FAME from the granular sludge based on the weight of dry sludge and the percentage of each FAME

對顆粒污泥中的細菌進行門水平上的分析(圖5a),發現變形菌門Proteobacteria和擬桿菌門Bacteroidetes占優勢,其中Proteobacteria的比例大于70%.隨著曝氣量的增加,Proteobacteria的比例略有下降,但Bacteroidetes的比例卻明顯提高.曝氣量為42L/(min·m3)時,厚壁菌門Firmicutes比其余情況更高,約占9%.此外,Gracilibacteria的比例在曝氣量為167L/(min·m3)時明顯增高.如圖5b所示,曝氣量過低時,叢毛單胞菌Comamonadaceaeunclassified在細菌中占絕對優勢(占46%).此外,Tolumonas,Photobacterium和Lactococcus也是含量較高的菌種,各占7～9%.許多研究表明Comamonadaceae含有C16:0,C16:1和C18:1等脂肪酸[12-14].十六烷酸(C16:0)是Tolumonas osonensis sp.最主要的脂肪酸[15],碳數為16的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸則是Photobacterium中最主要的脂肪酸[16]. Lactococcus lactis細胞膜上主要的脂肪酸為十六烷酸(C16:0)和十八烯酸(C18:1)[17].這些細菌均含有碳數為16的脂肪酸,因此曝氣量為42L/(min·m3)時,生物柴油中碳數為16的脂肪酸酸甲酯(C16:0,C16:1)的產量最高.曝氣量為167L/(min·m3)時,Comamonadaceae的比例下降到9%,但Tolumonas和Photobacterium的含量大幅上升,分別占31%和21%.因此,曝氣量為167L/(min·m3)時,生物柴油中仍有較高的棕櫚酸甲酯(C16:0)和棕櫚油酸甲酯(C16:1).曝氣量為667L/(min·m3)時,最主要的四類細菌分別是Comamonadaceae(12%),Photobacterium(18%),Flavobacterium(9%)和Hydrogenophaga(10%),而Tolumonas的比例有明顯的下降,僅為1%.Hydrogenophaga含有較多的十八烯酸[18],有助于提高生物柴油中油酸甲酯(C18:1)的含量.

對顆粒污泥中的真菌進一步鑒定(圖6a),結果表明曝氣量為42和167L/(min·m3)時,顆粒污泥的真菌部分幾乎完全由子囊菌門Ascomycota構成,其比例大于99%.當曝氣量為667L/(min·m3)時,顆粒污泥的真菌多樣性更為豐富,Ascomycota的比例下降到82%,另外還有褐藻門Ochrophyta(12%),Ciliophora(3%)等.圖6b給出了真菌在屬水平上的分析結果,Dipodascus和Hypocreales都屬于子囊菌門Ascomycota,但Hypocreales只出現在曝氣量為667L/(min·m3)的情況下.褐藻門Ochrophyta被進一步鑒定為Spumella. Dipodascus是一種酵母菌,屬于Dipodascaceae科,Botha和Kock1[19]在Dipodascaceae中提取出亞油酸(C18:2).Dipodascu在顆粒污泥中的出現,大大提高了生物柴油中亞油酸甲酯(C18:2)的含量(圖6).

圖5 顆粒污泥細菌菌群結構Fig.5 The bacterial population structure of granular sludge in the three SBRs

圖6 顆粒污泥真菌菌群結構Fig.6 The fungal population structure of granular sludge in the three SBRs

3 結論

3.1 曝氣量需控制在一個適中的水平才有利于微生物累積油脂.當曝氣量太高時,微生物生長速率太快,降低了微生物的油脂量.曝氣量太低時,微生物油脂產量也會減少.當曝氣量為167L/(min·m3)時,單位污泥的生物柴油產量較高,為(48.62 ± 1.36) mg/g SS.

3.2 不同曝氣條件下的菌群結構有顯著差別,曝氣量為167L/(min·m3)時,真菌比例最高,達到8.57%,而細菌中的Tolumonas和Photobacterium含量也大幅上升,分別占31%和21%,菌群結構的差異可能是導致油脂產量不同的主要原因.

3.3 曝氣量較低時,顆粒污泥傾向于累積更多棕櫚酸 (C16:0)和棕櫚油酸(C16:1);曝氣量為167L/(min·m3)時,油酸甲酯(C18:2)大幅增加,該油脂組分的變化可能與顆粒污泥中出現的酵母Dipodascus有很大的關系.

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