蠟樣芽孢桿菌中甲酸脫氫酶基因產氫研究

王海燕,郝瑞霞,趙雅琪,劉 偉,程水源,王冕超,徐嵐婷 (.北京工業大學,區域大氣復合污染防治北京市重點實驗室,北京 0024；2.北京工業大學建筑工程學院,北京 0024；.北京工業大學生命工程學院,北京0024)

當今世界面臨嚴重的能源危機及環境污染問題,生物制氫因其在生產過程中減少了能源消耗并且在使用過程中沒有污染而成為科學界的研究熱點[1-3].厭氧細菌、光合細菌、藍藻等原核微生物和某些真核藻類均可產生氫氣,如從污泥中分離出的發酵產氫菌Pantoea agglomerans在pH值為6.0時的產氫量達到(2.39±0.08)mol H2/mol葡萄糖[4],而廣泛存在于這些微生物中的氫酶是導致其產氫的關鍵酶.大腸桿菌為兼氧菌,其產生氫氣則是依賴甲酸氫酶系統FHL[5-6],該系統由氫酶3和甲酸脫氫酶基因(fdhF)構成,在該系統作用下可將甲酸鹽氧化產生H2和CO2.

腸桿菌科微生物是一群具有高效產氫能力的兼性厭氧微生物.在產氫方面有幾大優勢:產氫速率高、利用底物范圍廣、對氧敏感性較低及能耐受較高的氫分壓等.蠟樣芽孢桿菌在生物制氫方面除具備腸桿菌科的共性外,本實驗室的前期研究發現,該菌能利用葡萄糖和淀粉產氫[7],并且具備較高的產氫速率,從而說明其體內存在能夠催化放氫的氫酶.目前轉基因技術在環保、能源等領域有著廣泛應用[8-9].為了深入調查蠟樣芽孢桿菌放氫的功能基因,本文采用分子生物學手段和轉基因技術對蠟樣芽孢桿菌中的氫酶基因進行了分離純化,并對其相應表達蛋白的產氫性能進行了研究.由于厭氧實驗條件在實踐中較難操作且成本較高,同時為了驗證蠟樣芽孢桿菌中是否存在fdhF基因及其構建的重組蛋白能否通過過量表達來促進H2生成,本文在非厭氧條件下對蠟樣芽孢桿菌的fdhF基因進行了分離純化,并構建質粒及轉入大腸桿菌中,對其催化放氫的特性進行了初步研究.

1 材料與方法

1.1 菌種與質粒,化學試劑

大腸桿菌BL21、DH5α感受態購自Takara寶生物公司(大連),蠟樣芽孢桿菌基因組由本實驗室分離菌種并提取.

Taq DNA聚合酶購自Takara寶生物公司(大連),切膠回收試劑盒購自康為世紀,pGM-T Fast Ligation Kit、質粒小提取試劑盒購自TianGen天根生化科技有限公司(北京),5×loading buffer#GR0502、DNA Marker250bp-ⅡDNA ladder GsDL2502購自Generay,瓊脂糖購自BioWest,酵母提取物和蛋白胨購自OXOID,PCR儀2720Thermal Cyler購自Applied Biosystem,電泳儀TYY-7C型由北京六一儀器廠生產,高速冷凍離心機Centrifuge購自eppendorf,恒溫培養箱由BLUE PARD生產,恒溫金屬浴購自DRY BATH,凝膠成像儀購自Biorad.

LB液體培養基(/100mL):胰蛋白胨1.0g,酵母提取物0.5g,NaCl 1.0g,115℃高壓蒸汽滅菌20min.

LB固體培養基(/100mL):胰蛋白胨1.0g,酵母提取物0.5g,NaCl 1.0g,瓊脂粉1.5g,115℃高壓蒸汽滅菌20min.50℃左右倒入培養皿中,冷卻至凝固.帶氨芐抗性的平皿制備方法為在倒平皿前加入終質量濃度100μg/mL的氨芐青霉素.

50×TAE:Tris 242g,冰醋酸57.1mL,0.5mol/L EDTA(pH8.0)100mL,定容至1L.

PBS溶液(/1L):NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4·12H2O 3.58g,KH2PO40.27g.

SDS電泳緩沖液(/1L):Tris 30g,Glycine 144g,SDS 10g.

電轉液(/100mL):Glycine 0.44g,Tris 0.38g,甲酸20mL.

一抗為His-Tag 鼠源單抗,購自Proteintech公司;二抗為DyLight800標記的羊抗鼠抗體,購自KPL公司.

含金屬離子的化合物:亞硒酸鈉(Na2SeO3)購自麥卡希試劑;鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)、硫酸錳(MnSO4·H2O)、氯化鎳(NiCl2·6H2O)購自天津市福晨化學試劑廠;硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、氯化鐵(FeCl3·6H2O)、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)購自北京化工廠.

1.2 細菌基因組提取

采用大連寶生物公司的TaKaRa系列Code No.DV810A基因組提取試劑盒進行基因組提取.

(1)細菌的培養:

從平板培養基上挑選單菌落接種至1～4mL的液體培養基中過夜培養

(2)取1～4mL的過夜培養菌液,10000r/min離心2min,棄上清.

(3)用150 μL的SP Buffer(含RNase A1)充分懸浮細菌沉淀.

(4)加入20 μL Lysozyme溶液,混勻后室溫靜置5min.

(5)加入30 μL EDTA Buffer,混勻后室溫靜置5min.

(6)加入200 μL的Solution A,劇烈震蕩后65℃保溫10min.

(7)加入400μL的Solution B,劇烈震蕩15s.

(8)加入650μL Solution C, 上下顛倒均勻混合.

(9)12000r/min離心1min.

(10)先棄去上層有機相,然后將水相溶液移入預先置于1.5mL離心管上的Filter Cup中,12000r/min離心1min.

(11)棄Filter Cup,在濾液中加入450μL的DB Buffer,均勻混勻.

(12)將試劑盒中Spin Column安置于Collection Tube上.

(13)將上述操作11的混合液移至Spin Column中,12000r/min離心1min,棄濾液.

(14)將500μL的RNase A加入至Spin Column中,12000r/min離心1min,棄濾液.

(15)將700μL的RNase B加入至Spin Column中,12000r/min離心1min,棄濾液.

(16)重復步驟15.

(17)將Spin Column安置于新的1.5mL的離心管上,在Spin Column膜的中央處加入60μL的滅菌蒸餾水,室溫靜置1min.

(18)12000r/min離心1min洗脫DNA.-20℃保存所提基因組溶液.

1.3 蠟樣芽胞桿菌的fdhF基因擴增

在Genebank中檢索蠟樣芽胞桿菌產氫相關基因fdhF,并通過http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer網站設計引物,并在5’端加上線性化載體末端同源的堿基序列,引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,序列如下:

以蠟樣芽孢桿菌基因組總DNA為模板,PCR擴增其基因fdhF.

1.4 質粒DNA轉化

50μL感受態細胞中加DNA連接產物5μL,輕輕旋轉以混勻內容物,冰浴30min;42℃水浴90s,立即冰浴2min,加入400μL預熱至37℃的LB液體培養基,37℃溫育60min,將適當體積的轉化細胞涂在含相應抗生素的LB固體平板培養基上,37℃倒置培養16～18h后出現菌落.

1.5 蛋白印跡

蛋白質印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot.它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法.原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色.通過分析著色的位置和深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息.

(1)轉膜:準備與膠大小相同的NC膜1張,濾紙6張,電轉液分別浸泡SDS-PAGE膠10min、濾紙20s、NC膜20s,按從下至上將3層濾紙、膠、NC膜、3層濾紙放入電轉儀中,避免產生氣泡,電轉40min后,NC膜在PBS浸泡3min;

(2)封閉:用PBS配制的3%脫脂奶粉封閉液浸泡NC膜,4℃封閉過夜;

(3)一抗孵育:將NC膜放入抗體:封閉液:Tween20=1:1000:1溶液中,室溫搖床孵育4h;

(4)洗膜:PBST洗膜3次,每次5min,洗掉未結合的一抗;

(5)二抗孵育:將NC膜放入二抗:封閉液:Tween20=1:10000:1的溶液中,室溫搖床孵育1h,接著PBST洗膜3次,每次5min,洗掉未結合的二抗;

(6)取出NC膜,用近紅外雙色激光成像系統拍照,分析目的條帶.

1.6 基因在大腸桿菌BL21中的表達和Western blot分析

將表達質粒 pET32a-FDHF-His轉化入大腸桿菌BL21感受態細胞中,用含氨芐青霉素(AMP)的平板篩選陽性重組子,挑取單斑培養,并進行Western blot分析,以大腸桿菌BL21為對照.

將誘導表達后的菌體,取部分用適量細菌裂菌液重懸,超聲破碎,離心,移走上清,將沉淀部分用8mol/L尿素溶解.將上清、沉淀部分進行Western Blot分析,以大腸桿菌BL21作對照.

1.7 重組產氣腸桿菌產氫量測定.

(1)菌種的產氫性能測試

將轉化了pET32a-FDHF-His質粒的BL21菌進行產氫實驗.取容積為150mL的帶橡皮膠塞的玻璃瓶作為反應裝置.首先將純菌接種到LB培養基中進行富集培養,待其達到對數生長期時,用終濃度0.1mmol/L IPTG誘導,然后置于恒溫振蕩器中,在35℃,150r/min的條件下進行反應.分別在反應1h、24h、72h后測量產氣量和產氣組分與濃度.每組做三個平行實驗,結果取平均值.

(2)氣相及液相產物組分分析

氣相H2、CH4和CO2采用外標法進行定性定量分析,使用氣相色譜(SP—3420,北京分析儀器廠)的熱導檢測器,色譜柱為TDX01, 1.5m×3mm不銹鋼柱.進樣器、柱溫及檢測器溫度為80℃、80℃和120℃,氣相用50mL醫用注射器收集.

液相H2濃度測定采用DH200型溶解氫檢測儀(Clean instruments).

1.8 芐基紫精的還原實驗

配制緩沖液b:25mmol/L MES(pH 6.0),50mmol/L硫酸鈉,3mmol/L疊氮化鈉,2mmol/L DTT.將菌體沉淀,加入適量緩沖液b,超聲破碎,離心,留取上清.酶活性檢測的溶液,含50mmol/L Tris HCl(pH 7.5),20mmol/L甲酸鈉和2mmol/L benzyl viologen dichloride(芐基紫精).實驗中,配制2倍酶活性檢測液,取0.5mL的2倍溶液,加入菌體蛋白上清適量(蛋白質量濃度配成1mg/mL),補水,配制成1mL反應體系.每隔1min,用分光光度計檢測一次溶液的OD578數值,測量約20min.

2 結果與討論

2.1 蠟樣芽胞桿菌的fdhF基因擴增與比對

蠟樣芽胞桿菌的fdhF基因擴增后進行了測序.結果顯示該基因全長2937bp,GC含量46.5%,編碼978個氨基酸,與已報道的蠟樣芽孢桿菌Q1的fdhF基因(GenBank No.CP000227.1)同源性達到100%.

2.2 蠟樣芽孢桿菌fdhF的重組表達載體構建及在大腸桿菌BL21中的表達

將fdhF的引物送至中美泰和公司構建質粒,由本實驗室提供蠟樣芽胞桿菌基因組,質粒構建在表達載體pET32a上并融合His標簽,重組的質粒命名為pET32a-FDHF-His.如圖1,質粒融合了AMP抗性和His標簽.

圖1 重組質粒 pET32a-FDHF-His的構建Fig.1 Detailed map of recombinant pET32-FDHF-His plasmid

圖2 重組FDHF蛋白的Western blot 分析Fig.2 Western-blot analysis of recombinant FDHF protein in E. coli BL21cells

將誘導表達后的菌體,進行Western Blot分析,以大腸桿菌BL21作對照.如圖2所示,泳道1為pET32a-FDHF-His上清,泳道2為對照未轉化誘導的大腸桿菌BL21上清,泳道3為pET32a-FDHF-His的沉淀,泳道4為對照未轉化誘導的大腸桿菌BL21沉淀,由圖2可見在上清中fdhF基因所表達的目的蛋白量較對照有微弱增加,在沉淀中有fdhF表達的蛋白存在,表明fdhF基因在大腸桿菌BL21 中實現了表達.

2.3 金屬元素對甲酸脫氫酶基因產氫的影響

一些研究[10-11]指出痕量含鉬的酸根離子和含硒的亞硒酸根離子對大腸桿菌中甲酸脫氫酶的生成具有影響,而且在腸桿菌中氫酶主要為鎳鐵氫酶([NiFe]-hydrogenase).另外一些微量元素對腸桿菌的生長也有一定影響[12],考慮這些因素,本實驗在培養基中分別加入、、Ni2+、Fe2+等金屬離子,使其在培養基中濃度均為4μmol/L,觀察其對重組菌的產氫影響.由于重組蛋白的功能表達需添加IPTG誘導后才能顯現,因此實驗中凡涉及重組E.coli BL21菌的培養均是添加了IPTG加以誘導的,而未重組的E.coli BL21菌則是無需添加IPTG進行誘導的.

實驗結果如圖3所示.添加Mn2+和的反應器中的H2產率是添加其他金屬離子的2～3倍,說明和對含有fdhF基因重組菌的產氫具有一定促進作用.而Fe2+等[13]對[NiFe]氫酶基因具有促進產氫作用的金屬離子卻未促進fdhF基因提高H2產率.此外,實驗結果還顯示離子并未提高重組菌的H2產率,僅為Mn2+的1/3.各金屬元素對甲酸脫氫酶基因提高產氫率的作用從大到小排序依次為:Mn2+＞＞Ni2+＞Mg2+＞Fe2+＞＞ Fe3+.

圖4為含有pET32a-fdhF-His質粒的重組菌經超聲破碎后沉淀產物的Western Blot分析結果,泳道3、5、7分別為未添加金屬元素、添加、添加且均經IPTG誘導的重組E.coli BL21沉淀,泳道空白為對照未轉化的E.coli BL21沉淀,實驗結果顯示在沉淀中除空白泳道外的其他泳道均在相應位置有條帶,表明pET32a-fdhF-His質粒在E.coli BL21中實現了表達,而且添加離子和離子的蛋白量均比未添加任何金屬離子的蛋白量有所增加,但增加量比較接近.說明離子和離子均對含fdhF基因的重組菌的表達有一定促進作用,而且促進的效果較一致.

圖3 不同金屬元素對重組菌產氫的影響Fig.3 Effect of various metal ions on hydrogen production of recombinant E. coli strains

圖4 添加金屬離子的Western blot分析Fig.4 Western-blot analysis of recombinant FDHF protein in E. coli BL21 cells cultured with metal ions

2.4 不同底物對甲酸脫氫酶產氫的影響

由于fdhF基因通過氧化甲酸產生質子,進而通過氫酶3還原質子生成H2,因此觀察甲酸鹽對重組大腸桿菌產氫的影響是必要的.此外,大腸桿菌[14]可以降解葡萄糖生成丙酮酸和乙酸輔酶A,進而代謝生成乙酸、乙醇、乳酸和甲酸,甲酸可以進一步通過FHL(formate hydrogenlyase)系統將甲酸鹽氧化生成CO2,然后利用氫酶3將質子還原而產生H2.涉及的方程如式(1)～(4)所示.

由方程(1)、(2)看出每摩爾葡萄糖的產氫量為4mol,每摩爾甲酸的產氫量為1mol,因此理論上1摩爾葡萄糖產氫量是1mol甲酸鹽產氫量的4倍.由方程(3)、(4)看出生成的H2和CO2還會被繼續利用生成乙酸、CH4等產物,因此在計算H2產量時應該考慮到H2的消耗量.

由圖5-A看出,未誘導的反應裝置中,以葡萄糖為底物的產氫量約是甲酸鹽為底物的1.48倍,而在誘導的反應裝置中,以葡萄糖為底物的培養基中重組菌的產氫量僅是甲酸鹽的1.09倍,從而說明含有pET32a-fdhF-His質粒的重組菌經誘導后能更好的利用甲酸鹽,從而促進H2的生成.

圖5 葡萄糖和甲酸鹽對fdhF基因的影響Fig.5 Effect of glucose and formate on recombinant E. coli strains

由方程(4)可知,細菌代謝產生的CO2和H2可繼續反應生成CH4,圖5-B的數據是在剛開始產生CH4時得出的,由圖看出,以葡萄糖為底物的培養基中重組菌的產甲烷量無論誘導與否均低于甲酸鹽培養基中的產CH4量,而在誘導的反應裝置中,以葡萄糖為底物的培養基中的CH4產量遠遠低于甲酸鹽為底物的CH4產量,甲酸鹽底物組與葡萄糖底物組的CH4產量比值從未誘導的1.18倍提高到誘導的2.45倍.說明fdhF基因誘導后能更快地利用甲酸鹽,加速H2的生成,進而在產CH4基因作用下加速CH4生成.因此甲酸鹽為底物也有利于提高產CH4速率.而大腸桿菌在代謝葡萄糖產氫過程中[15-16],葡萄糖被逐步降低碳鏈長度,最終產生甲酸,然后為fdhF基因所利用.因此產CH4速率低于甲酸鹽為底物的反應裝置.

圖5-C為不同底物CO2的產量,由此圖看出,以葡萄糖為底物時重組菌的CO2產量約是甲酸鹽為底物時的2～3倍,這與方程(1)(2)相吻合,即理論上以葡萄糖為底物的CO2產量應為甲酸鹽為底物的2倍.由于CO2是溫室氣體[17-18],減排更有利于環境改善,本實驗中,對重組菌而言,以甲酸鹽為底物更有利于溫室氣體CO2的減排.

圖5-D為液相H2的濃度值,由圖看出,液相H2濃度的高低與氣相中H2產量的大小趨勢較一致.即氣相中H2產量大,其對應的液相中H2的濃度也高.此外,根據誘導后的數據分析可以看出,以葡萄糖為底物,液相H2濃度約是甲酸鹽為底物的1.7倍,高于對應的氣相中H2產量比值的1.09倍,說明重組菌經誘導后蛋白得以表達,其產生的H2首先經細胞壁釋放到液體培養基中,當液相中的H2達到一定分壓時,繼續釋放到氣相中,因而液相中濃度高低更能反映出fdhF基因對不同底物的利用情況.另外,一些研究表明[19],高H2分壓抑制菌株產氫,因此將液相中的H2及時釋放到氣相中并進而從氣相釋放到反應系統外部,才能使重組菌繼續產生更多的H2.通過提高培養箱轉速或向菌液中通入N2將H2釋放到系統外[20].

表1為添加IPTG誘導劑1h后測得的分別以葡萄糖和甲酸鹽為底物的重組菌在誘導及未誘導情況下的產氫率,從上述數據看出,經誘導重組菌的產氫率明顯高于未誘導的菌株,以葡萄糖為底物時,提高了20倍,甲酸鹽為底物時提高了8.1倍.進一步說明構建的含有fdhF基因的重組菌具有提高產氫速率的功能.

表1 不同底物重組菌株產氫率的比較Table 1 Comparison of hydrogen production rates of recombinant strains with different substrates

綜合上述分析得出,新構建的重組菌得到了表達,且重組的含有蠟樣芽胞桿菌fdhF基因的大腸桿菌既可利用葡萄糖也可利用甲酸鹽為底物進行產氫反應,誘導后產氫量分別為0.73molH2/mol葡萄糖和0.20molH2/mol甲酸鹽.同時,從產氫量分析,甲酸鹽對fdhF基因的影響大于葡萄糖的影響.但從實際操作來看,也有研究[21]認為葡萄糖為底物比甲酸鹽更具有可操作性.

2.5 fdhF基因對芐基紫精的還原特性研究

芐基紫精(BV)[22]在氫酶產氫過程中起著電子供體的作用,因還原時變成深藍—紫色而得名,當菌液中加入一定濃度BV,可通過菌液吸光度值判斷菌株對BV還原作用的大小,進而說明菌株氫酶活性水平.還原作用越強,吸光度值越大,氫酶活性越高.由于在大腸桿菌中fdhF基因與氫酶3共同作用產生H2,為了觀察新構建的重組大腸桿菌對BV還原作用的影響,設置了3組實驗裝置,分別為對照組(未重組的E.coli BL21),添加0.2mmol/L IPTG誘導劑的重組E.coli BL21和不添加IPTG誘導劑的重組E.coli BL21.由圖6可見,誘導組較未誘導和對照組均有一定提高,說明新構建的含有fdhF基因的重組蛋白加強了BV還原性,即重組大腸桿菌比未重組的大腸桿菌利用BV提供電子的能力有所加強,亦即產氫能力提高了,進一步表明重組菌可改善發酵產氫效率.

圖6 重組大腸桿菌的BV還原性Fig.6 BV reducibility of recombinant E. coli strains

3 結論

3.1 將蠟樣芽胞桿菌中fdhF基因構建在表達載體pET32a上并融合His標簽,使其具有AMP抗性.經Western Blot分析表明重組蛋白在E.coli BL21 中實現了表達.

3.2 Mn2+和提高了重組E.coli BL21菌的H2產率.經Western Blot分析和可促進pET32a-fdhF-His在E.coli BL21中的表達.

3.3 含重組蛋白的E.coli BL21菌經誘導后可利用甲酸鹽促進H2生成,同時可提高產CH4的速率并減少CO2的排放.以葡萄糖為底物時液相H2濃度約是甲酸鹽為底物時的1.7倍.

3.4 構建的含有蠟樣芽胞桿菌fdhF基因的重組蛋白加強了BV還原性,表明含有該重組蛋白的E.coli BL21菌能夠促進發酵產氫效率.

[1] Gabrielyan L, Sargsyan H, Trchounian A. Biohydrogen production by purple non-sulfur bacteriaRhodobacter sphaeroides: Effect of low-intensity electromagnetic irradiation[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B, 2016,162(C):592-596.

[2] Zhang S C, Lai Q H, Lu Y, et al. Enhanced biohydrogen production from corn stover by the combination ofClostridium cellulolyticumand hydrogen fermentation bacteria [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2016,122(4):482-487.

[3] Dhar B R, Elbeshbishy E, Hafez H, et al. Hydrogen production from sugar beet juice using an integrated biohydrogen process of dark fermentation and microbial electrolysis cell [J]. Bioresource Technology, 2015,198:223-230.

[4] 劉洪艷,朱大玲,王文磊.一株耐酸產氫突變株Pantoea agglomerans的篩選與產氫特性 [J]. 中國環境科學,2012,32(1): 125-129.

[5] Wagner R, Andreesen J R. Differentiation betweenClostridium acidiuriciandClostridium cylindrosporumon the basis of specific metal requirements for formate dehydrogenase formation[J]. Archives of Microbiology, 1977,114(3):219-224.

[6] Maeda T, Sanchez-Torres V, Wood T K. Metabolic engineering to enhance bacterial hydrogen production [J]. Microbial Biotechnology, 2008,1(1):30-39.

[7] 王海燕,程水源,孟 靜.蠟狀芽孢桿菌的篩選及其產氫性能 [J].北京工業大學學報, 2014,40(10):1540-1546.

[8] 胡春輝,于 浩,趙陽國,等.高效耐鹽柴油降解菌的篩選、鑒定及降解基因 [J]. 中國環境科學, 2017,37(11):4251-4258.

[9] 張鵬幸,許 靜,盧劍功,等.含熒光素酶四膜蟲B2086-LUC全細胞生物傳感器的構建及其對重金屬離子的響應 [J]. 中國環境科學, 2013,33(6):1075-1080.

[10] Lester R L, Demoss J A. Effects of molybdate and selenite on formate and nitrate metabolism in Escherichia coli [J]. Journal of Bacteriology, 1971,105(3):1006-1014.

[11] Enoch H G, Lester R L. Effects of molybdate, tungstate, and selenium compounds on formate dehydrogenase and other enzyme systems inEscherichiacoli[J]. Journal of Bacteriology,1972,110(3):1032-1040.

[12] Leonhardt U, Andreesen J R. Some properties of formate dehydrogenase, accumulation and incorporation of 185W-tungsten into proteins ofClostridium formicoaceticum[J].Archives of Microbiology, 1977,115(3):277-284.

[13] Pinske C, Sawers R G. The importance of iron in the biosynthesis and assembly of [NiFe]-hydrogenases [J]. Biomolecular Concepts, 2014,5(1):55-70.

[14] Shimizu K. Metabolic regulation of a bacterial cell system with emphasis onEscherichia colimetabolism [J]. ISRN Biochemistry,2013,2013(6):645983.

[15] Lara A R, Taymaz-Nikerel H, Mashego M R, et al. Fast dynamic response of the fermentative metabolism ofEscherichia colito aerobic and anaerobic glucose pulses [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2009,104(6):1153-1161.

[16] Asano M, Basieva I, Khrennikov A, et al. Quantum-like model for the adaptive dynamics of the genetic regulation ofE. coli'smetabolism of glucose/lactose [J]. Systems and Synthetic Biology,2012,6(1/2):1-7.

[17] Marx G, Miskolci F. The CO2 greenhouse effect and the thermal history of the atmosphere [J]. Advances in Space Research,1981,1(14):5-18.

[18] Knox S H, Sturtevant C, Matthes J H, et al. Agricultural peatland restoration: effects of land-use change on greenhouse gas (CO2and CH4) fluxes in the Sacramento-San Joaquin Delta [J]. Global Change Biology, 2015,21(2):750-765.

[19] Mandal B, Nath K, Das D. Improvement of biohydrogen production under decreased partial pressure of H2 byEnterobacter cloacae[J]. Biotechnology Letters, 2006,28(11):831-835.

[20] Li X, Wang Y, Zhang S, et al. Effects of light/dark cycle, mixing pattern and partial pressure of H2 on biohydrogen production byRhodobacter sphaeroidesZX-5 [J]. Bioresource Technology,2011,102(2):1142-1148.

[21] Kraemer J T, Bagley D M. Improving the yield from fermentative hydrogen production [J]. Biotechnology Letters, 2007,29(5):685-695.

[22] 周燦燦,唐 波,羅 瑋,等.電子載體對丁醇發酵的影響 [J]. 生物加工過程, 2012,10(5):1-6.