利用分子信標和EXO III放大熒光信號快速檢測Ag+

賀氣志,羅懷青,陳珂珂,徐 倩,唐 亮,寧 毅 (.長沙醫學院基礎醫學院,湖南 長沙 4029；2.湖南中醫藥大學醫學院,湖南 長沙 40208)

核酸適配體因與金屬離子結合具有很高的特異性,已被應用于新型傳感器的開發.已有報道Ag+能夠特異性的與2個胞嘧啶(C)結合形成C-Ag+-C復合物,富含C的核酸適配體在Ag+存在時能通過自由鏈形成穩定的發卡結構,基于此已發展一些具有高度選擇性的生物傳感器用于檢測Ag+[10-12].盡管核酸適配體探針的特異性很強,但是俘獲靶標量不大,導致靈敏度不高.

近年來,信號放大技術已逐步被應用于高靈敏度臨床檢測、基因治療和環境監測等領域[13-14].通常通過納米材料和分子生物學技術放大信號,如鏈替代擴增反應[15]、連接酶鏈反應[16]、靶標循環[17]等.其中基于酶切靶標循環的信號放大技術,被認為是信號放大的非常有效的方法[18].

核酸外切酶是一類能夠從一端開始順次水解磷酸二酯鍵的核酸酶,其產物為單個核苷酸,廣泛應用于傳感器設計.核酸外切酶III(EXO III)作用于雙鏈DNA,沿3’→5’方向逐步切去單個核苷酸,無堿基特異性,但是不能從3’端突起的核酸鏈開始降解.最近有報道利用EXO III的水解特性放大信號用于檢測DNA[19-21].由于熒光分析法具有靈敏度高,操作簡便等優點,廣泛應用于環境污染物檢測[7,9,22].然而,到目前為止還沒有基于熒光能量共振轉移(FRET)原理將分子信標與EXO III結合起來用于檢測重金屬離子的研究.

本研究設計熒光分子(FAM))和淬滅基團(BHQ)標記的分子信標,利用Ag+核酸適配體的高度特異性并結合EXO III的酶切特性有效放大熒光檢測信號構建靈敏度高、特異性強、成本低的快速檢測Ag+的生物傳感器,為Ag+的檢測提供新的方法.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

本研究所用的DNA全部購自上海生工生物有限公司,如表1所示.EXO III購買于MBI公司.

表1 設計的核苷酸序列Table 1 Oligonucleotides designed in this study

所有化學試劑均購自于國藥集團,純度為分析純.將AgNO3溶解于超純水制備所需Ag+濃度.0.02μm濾膜,Milli-Q型純水儀(Millipore,美國),LS55型熒光分光光度計(PerkinElmer,美國),PL203型電子天平(梅特勒一托利多公司,瑞士),DELTA-320pH計(梅特勒,瑞士).

1.2 檢測條件的優化

反應體系的pH值和酶切時間是影響該方法檢測效率以及靈敏性的重要因素,因此對這2個條件進行了優化.將Tris-HCl反應體系的pH值分別設定6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8六種不同梯度.分別在不同pH值反應體系中將濃度200nmol/LAg+與探針、分子信標室溫孵育50min,讓其充分結合,然后加入EXO III,45min后測定體系的熒光值.此外,將濃度為200nmol/LAg+與探針、分子信標室溫孵育50min,讓其充分結合,然后加入EXO III,每5min測定體系的熒光值,對照組Ag+濃度為0,方法同靶標組.本研究所有實驗均重復3次,取其平均值.

城市平均投資回報率是指投資到除港口外的其他產業平均得到的收益，先把城市內上市公司作為樣本，篩選出對經濟有貢獻的指標(如：應付職工薪酬、固定資產折舊額、營業利潤和稅收等)，得到其經濟的貢獻量，再計算其資產總額的貢獻率。

1.3 靈敏度分析

設定Ag+濃度為0, 0.1, 0.5, 1, 20, 60, 100,150, 200, 300nmol/L,分別加入到探針DNA和分子信標混合液中室溫孵育50min,使靶標、探針、分子信標充分結合形成特定的空間結構.然后加入2U的EXO III,室溫孵育50min,在激發波長495nm,發射波長530nm 下測定體系的熒光值.該反應體系用Tris-HCl(pH7.4)定容至100μL,探針DNA終濃度為50nmol/L,分子信標終濃度為200nmol/L.本研究所有實驗均重復3次,取其平均值.

1.4 特異性分析

為考察該體系的特異,以Ag+為實驗組,以Mn2+、Pb2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+為對照組,所有離子濃度均為100nmol/L,按上述方法測定該體系的熒光值.為了進一步驗證體系的抗干擾能力,將上述7種非靶標金屬離子各2μmol/L與200nmol/L Ag+一同加入體系反應后,在激發波長495nm,發射波長530nm下測定熒光值.

1.5 對實際樣品中Ag+的檢測

為考察該方法對實際樣品中Ag+檢測能力,對湘江水進行檢測.因考慮到湘江水含有其他基質,首先用濾紙進行過濾去除大顆粒物質,再用0.02μm的超濾膜對其進行過濾,再將pH值調整至7.4[7].將不同濃度梯度的Ag+加入體系,體系中溶液為體積比1:1的湘江水與Tris-HCl (pH7.4),反應后在激發波長495nm,發射波長530nm下測定熒光值.

2 結果與分析

2.1 生物傳感器的設計原理

設計新型DNA探針,包含中間核酸適配體序列和兩端的與分子信標互補序列.當體系中不存在Ag+時,分子信標與DNA探針在反應液中互不干擾,處于游離狀態,分子信標兩端的熒光分子和淬滅分子由于距離太近發生能量共振轉移,熒光被猝滅;當向體系中加入Ag+時,DNA探針的核酸適配體部分與靶標結合形成發卡結構[12],探針的兩端序列則會拼接起來與分子信標形成互補的雙鏈.加入EXO III后,由于DNA探針3’端的4個堿基被硫代處理從而能防止其被EXO III酶解[20],因此,EXO III將從分子信標的3’端依次降解核酸,使得熒光分子FAM遠離BHQ而被釋放到溶液中,體系熒光值增大.而靶標與探針DNA結合的復合物則能與分子信標結合繼續下一個循環反應,產生更多游離的熒光分子,體系的熒光信號被不斷放大,如圖1所示.分子信標能與探針的兩端拼接互補形成雙鏈是本體系的關鍵所在.如果DNA探針適配體區域與分子信標互補區域間隔的堿基數過多,將會導致拼接排列不緊密而影響分子信標和探針的結合效率;如果間隔的堿基數太少,由于堿基與堿基之間的空間位阻將會阻礙分子信標與探針的結合.因此設計間隔堿基數分別為0,1,2,3,4 bp的5種探針,分別比較5種探針檢測相同濃度的Ag+(200nmol/L)得到的信噪比,如圖2所示.P3間隔2個堿基所產生的信噪比最大,說明這種探針與分子信標的結合效果最好,后續實驗均采用此探針.P1信噪比接近1,說明間隔太短,由于空間位阻,分子信標基本不能與探針拼接形成雙鏈.P5信噪比高于1但是低于P3,說明間隔太長,分子信標與探針的結合效率不理想.

圖1 基于分子信標和EXO III活性放大信號對Ag+檢測的原理示意Fig.1 Schematic diagram for detection of Ag+ based on molecular beacon and signal amplification assisted by EXO III

圖2 DNA分子探針的優化Fig.2 The optimization of DNA probe

2.2 檢測條件的優化

圖3 檢測體系pH值和酶切時間的優化Fig.3 The optimization of pH and digestion time of the reaction system

反應體系在不同的pH值條件下,其檢測的熒光效率表現不同,如圖3(a)所示.pH值為7.4時,體系的熒光值達到最大,因此可以確定7.4為該體系的最佳pH值,后續所有實驗均采用此值.分子信標與探針互補配對后,在EXO III的作用下降解分子信標,釋放游離的FAM,體系熒光值增強.但如果酶切時間不夠,分子信標將無法完全被酶解從而釋放游離的FAM,同時Ag+/DNA探針復合物也無法釋放用于下一輪循環反應,這將會極大的影響檢測體系的熒光效率和靈敏度.因此,為達到最佳的檢測效果和檢測效率,探索酶切的最佳反應時間.如圖3(b)所示,5～50min內隨著酶切時間延長,熒光值的增加與時間成直線關系,50min后體系熒光值幾乎不再改變,結果表明FAM已完全釋放出來,此時的熒光效率最佳,因此我們選50min為最佳酶切時間.

2.3 靈敏度分析

圖4 Ag+的靈敏性分析Fig.4 The sensitivity analysis of the method for Ag+

為考察該檢測體系的靈敏度,將不同濃度梯度的Ag+分別加入到檢測體系中,記錄熒光值.如圖4,隨著Ag+濃度的增加, Ag+將與DNA探針形成C-Ag+-C復合物,探針形成發卡結構,使得兩端序列拼接起來與分子信標互補形成雙鏈,在EXO III的作用下,分子信標水解釋放游離FAM,同時探針與Ag+形成的發卡結構可以進入下一個循環與分子信標結合,產生更多游離的FAM,熒光強度不斷增加.當Ag+濃度大于200nmol/L時,熒光強度增加不顯著,說明Ag+與DNA探針結合已達飽和并形成穩定的雜交結構,導致分子信標被完全酶解,FAM完全釋放.該檢測體系在Ag+濃度為0.5～200nmol/L范圍內,熒光值與靶標濃度成線性關系(Y=0.950X+87.55,R2=0.994). Ag+濃度為0.1nmol/L的熒光品均值與背景信號的比值為3.05,即信噪比大于3具有檢測意義,因此其檢測下限(LOD)可達0.1nmol/L.該檢測體系比Xu等[10]構建的超敏電化學傳感器操作簡便,價格低廉.其LOD低于已報道的Wen等[23]構建基于石墨烯傳感器(1.0nmol/L)、Wei等[7]構建的Dnase I介導的納米石墨傳感器(0.3nmol/L).檢測體系的高靈敏度表明其具有實際應用前景.

2.4 特異性分析

圖5 Ag+的特異性分析Fig.5 The specificity analysis of the method for Ag+

在特異性分析中,將相同濃度的靶標離子與其他金屬離子加入反應體系中,在相同條件下反應后測定熒光值.如圖5所示,靶標離子的熒光值要遠大于其他非靶標金屬離子的熒光值,極易區分靶標離子和非靶標離子,因此具有很強的特異性.該體系的高度特異性歸功于DNA探針與Ag+形成C-Ag+-C復合物的特異性和親和力.進一步考察該體系檢測時的抗干擾能力,將其他非靶標金屬離子和靶標離子混合測定其熒光值,如圖6所示.其他金屬和靶標離子混合物的熒光值(曲線1)遠大于其他金屬混合液(曲線2),并且背景信號低(曲線3).結果表明,該方法檢測靶標的

熒光值與其他混合金屬的熒光值比值為5.5,即信噪比大于3,具有檢測意義因此具有高度的選擇性,并且在復雜體系中具有很強的抗干擾能力,優于已報道的電化學傳感器,碳納米傳感器等[5,7,23].

圖6 抗干擾能力分析Fig.6 Analysis of the Anti-interference ability

2.5 樣品的檢測

該方法在Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液中具有良好的檢測性能,而實際樣品成分比較復雜,影響因素較多,因此很多檢測方法在復雜環境中的表現不夠穩定,難以令人滿意.為了評價該方法在復雜環境的表現能力,進一步檢測湘江水中含有的Ag+濃度.如圖7所示,熒光值隨著河水中Ag+濃度的增加而增加,并在20～200nmol/L范圍內呈線性關系(R2=0.998).盡管湘江水中存在一定量的礦物質和有機物,但是該方法還是能很好地檢測出Ag+濃度,且最低檢測下限可達10nmol/L,低于世界衛生組織(WHO)對飲用水的標準(0.1mg/L).此外,為了探討樣品中其他物質對檢測體系的影響,我們對樣品中的Ag+進行回收,結果表明回收率達到99.1%～103%,其相對誤差處于1.0%～3.2%之間,如表2所示.由標回收率及相對誤差證實該檢測方法在樣品中也具有很好的表現.因此該方法具有較大的實際應用潛力.

圖7 實際樣品中Ag+的靈敏性分析Fig.7 The sensitivity analysis of the method for Ag+ in real samples

表2 實際分析樣品中Ag+ 的回收率Table 2 Recoveries of the proposed Ag+ assay in real samples

圖8 實際樣品中Ag+的特異性分析Fig.8 The specificity analysis of the method for Ag+ in real samples

為驗證該生物傳感器在實際樣品中的特異性表現,對含有濃度均為150nmol/L的靶標離子與其他金屬離子的湘江水樣品進行檢測.如圖8所示,其他非靶標金屬離子的熒光值遠低于靶標離子的熒光值,因此該傳感器在實際樣品檢測中同樣具有的很好特異性.

3 討論

本研究設計了一種操作簡單、特異性強和靈敏度高的DNA探針,構建了基于分子信標和EXO III的熒光信號放大的生物傳感器用于Ag+的檢測.

DNA探針中間部分為適配體序列,兩端為分子信標互補配對的序列.因為EXO II只能水解雙鏈DNA3’端的平端和凹斷,不能酶切凸端,在探針3’端多出4個堿基處于單鏈狀態,避免被EXO III酶切.當DNA探針與Ag+結合后形成發卡結構,兩端序列通過拼接與分子信標互補形成雙鏈,但如果拼接部分沒有間隔堿基,空間位阻大,分子信標則不能與之結合形成雙鏈,相反如果距離過大,也會影響雙鏈的形成,降低檢測效果.所以有必要探究探針的設計.

在分子信標與DNA探針與Ag+形成復合物雙鏈后加入EXO III,EXO III在體系中水解分子信標從而釋放游離的熒光分子,使得探針與靶標復合物進入下一個循環,再與分子信標結合,熒光信號被循環放大.因此酶切時間是影響該方法檢測的關鍵因素[7].

檢測方法的靈敏度和選擇性是評價優劣的關鍵.有很多研究報道利用Ag+核酸適配體結合碳納米材料,該方法選擇性高,但是1個靶標離子只能釋放1個熒光分子,熒光強度低,方法的靈敏度不夠高,且操作繁瑣.也有很多研究報道基于Ag+核酸適配體的電化學傳感器,該方法的靈敏度較高,但是傳感器構建復雜,操作繁瑣,還需特定昂貴的儀器設備.本研究利用核酸適配體結合分子信標和EXO III,使Ag+和適配體復合物反復與分子信標結合,然后水解產生FAM,一個靶標可產生多個熒光分子,因此熒光強度不斷被放大,靈敏度顯著提高,而且該方法操作簡便,成本低廉,也無需昂貴的儀器設備,極容易在基層實驗室完成Ag+檢測,因此具有很強的實用性.

很多方法在緩沖液中的檢測效果好,但是在實際樣品中的檢測卻差強人意.電化學傳感器很容易受復雜環境中帶電物質的影響,從而影響傳感器的表現[24].本實驗通過優化各類實驗條件并通過水樣品的抗干擾實驗證明該方法在實際樣品具有很高的靈敏性和很強的特異性,因此在污水、食品與中藥等樣品的檢測中具有很強的實用價值.

4 結論

4.1 DNA探針適配體區域與分子信標互補區域間隔堿基數為2個堿基時檢測的信噪比最大,說明這種探針與分子信標的結合能力最好.

4.2 在DNA探針與Ag+形成發卡結構,其兩端與分子信標形成雙鏈后加EXO III,酶切的最佳時間為50min,檢測的熒光值最大,檢測效率最高.

4.3 將靶標離子加入到探針DNA和分子信標混合液中室溫孵育50min,再加入2U的EXO III,室溫育50min,設置激發波長495nm,發射波長530nm測定體系的熒光光譜.其檢測下限(LOD)低至0.1nmol/L,且在Ag+濃度為0.5～200nmol/L范圍內,熒光值與靶標濃度成線性關系(R2=0.994).

4.4 該方法的特異性高,在檢測體系中加入非靶標離子,其熒光值很低基本等同于背景信號.當將大量非靶標離子和200nmol/L Ag+加入體系測得的熒光值是非靶標離子檢測的熒光值的6倍,說明該方法抗干擾能力強.

4.5 該方法在檢測湘江水實際樣品中的Ag+時,在0～200nmol/L范圍內呈線性關系(R2=0.998),其檢測下限可達到10nmol/L,低于世界衛生組織(WHO)對飲用水的標準(0.1mg/L),且特異性強.因此該方法具有很強的實際應用價值.

4.6 該方法操作簡單,成本低,不需要特殊昂貴的儀器設備,整個檢測過程不到2h,檢測速度快.

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