用正交實驗探究不同激素濃度組合對地被菊花序軸組織培養的影響

白俊峰 （北京市第十二中學 北京 100071）

進行植物組織培養時，激素的種類與濃度對外植體形成愈傷組織和芽的誘導效果不同。正交實驗設計是研究多因素、 多水平篩選的一種設計方法之一，它是根據正交性從全面實驗中挑選部分有代表性的點進行實驗，這些點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，正交實驗是一種高效、快速、經濟的實驗設計方法，可用較少的實驗，找到最優組合和趨勢最優組合。以地被菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）花序軸（圖1）為外植體，選取3 種常用的激素，它們分別是6-芐基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（ NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）； 每種激素選取3 個濃度，其中1 水平為0濃度，2 水平為非洲菊的最適濃度，3 水平為非洲菊的最適濃度加倍（表1）。將三因素三水平正交表應用到地被菊花序軸的不同激素濃度組合篩選中，具體實驗設計如表2。

表1 激素種類濃度表

表2 三因素三水平正交實驗設計表

1 材料與試劑

1）材料：地被菊幼花序，三角瓶，燒杯，酒精燈，剪刀等。

2）試劑：6-芐基嘌呤（6-BA），萘乙酸（NAA），2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），70%乙醇，2%次氯酸鈉。

3）儀器設備：超凈工作臺，光照培養架，高壓滅菌鍋，鼓風干燥箱。

2 過程與方法

2.1 準備工作

1）消毒劑的配制。按比例配制2%次氯酸鈉和70%乙醇。

2）激素母液的配制。分別配制1 mg/L 的6-芐基嘌呤（6-BA）母液，1 mg/L 的萘乙酸（ NAA）母液，1 mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）母液。

3）MS 培養基的配制與滅菌。按照說明配制MS 培養基，并按照三因素三水平正交試驗表添加激素，做好標記；118°C 高壓滅菌18 min，備用。

4）器械包裝和滅菌。將要使用的器械用牛皮紙包裹，165°C 干熱滅菌2 h，備用。

2.2 外植體消毒和接種 將地被菊幼花序用流水沖洗20 min，再用70%的乙醇處理后，于超凈工作臺內用無菌的鑷子剝離花序，取出花序軸（圖1），置于無菌錐形瓶內，先用70%的乙醇消毒30 s 后，用無菌水沖洗4 次，再用2%次氯酸鈉滅菌10 min，用無菌水沖洗4 次，備用；將已滅菌的花序軸置于無菌培養皿內，吸干水分，用無菌鑷子和解剖刀切十字花，均分成4 份，接種至培養基內。每瓶接種1個花序軸，每種培養基做6 個重復。

2.3 培養 將接種好的培養基置于無菌室內，（20±2）°C 的條件下，每日光照12 h，連續培養。初始日期為2016年7月13日。

2.4 觀察記錄 定期觀察并記錄，按照標準進行排序，根據愈傷的有無、愈傷的大小及高矮、愈傷的顏色對愈傷進行排序和打分。愈傷的打分標準為：愈傷無為0 分，有愈傷的，按照愈傷的大小、高矮、愈傷的顏色進行排序，排第一的為20 分，按照順序遞減2 分，分別為18、16、14、12、10、8、6、4、2；按照芽的有和無打分，無芽0 分，有芽的按照芽的高矮，芽的壯和弱，芽的多少進行排序和打分，排序后，排第一的為20 分，按照順序遞減2分，分別為18、16、14、12、10、8、6、4、2，若在同一水平，無法區分則得分相同，下一排序分數減4分，同時拍照。具體得分和分析見表3～表5，原始圖片見圖2、圖3。

3 結果與討論

3.1 實驗最優組合 實驗組內得分最高的組合為實驗最優組合。

3.1.1 愈傷的實驗最優組合 地被菊花序軸在接種后第18 天的時候，即7月31日可觀察到愈傷的組數為5、6、7、8、9 組，愈傷得分排序為6＞5＞8＞9＞7，在生長1 周后,除了對照組沒有分化出愈傷,其他組都分化出了愈傷, 愈傷得分排序為8＞6＞9＞7=4＞5＞3＞2，其中8 組優勢明顯（圖2），稱之為試驗最優組合（表3），8 組的激素濃度組合為A3B2C1，6-芐基嘌呤（6-BA）為3mg/L，萘乙酸（NAA）為0.2 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。

表3 花序軸原始得分記錄

3.1.2 芽的實驗最優組合 地被菊花序軸在接種第32 天時，即8月14日只有6 組和8 組有了芽的分化，6＞8，6 組稱之為芽的試驗最優組合（表5，圖3）。6 組的激素濃度組合A2B3C1，6-芐基嘌呤（6-BA）為1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。

3.2 趨勢最優組合 每個單因素選項加分和最高的組合為趨勢最優組合。

3.2.1 愈傷的趨勢最優組合 表4為8月7日的愈傷分化情況，利用直觀分析的方法，根據數據分析，愈傷的趨勢最優組合為A3B3C1，6-芐基嘌呤（6-BA）為3.0 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。

表4 直觀分析地被菊花序軸第25 天愈傷

3.2.2 芽的趨勢最優組合 利用直觀分析的方法,從表5看到8月14日的芽分化表，芽的趨勢最優組合是A2B3C1，6-芐基嘌呤（6-BA）為1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L，芽的試驗最優組合與趨勢最優組合吻合。

表5 直觀分析地被菊花序軸第32 天芽

3.3 芽的誘導

1）直接誘芽，可選擇6 組培養基，直接培養45 d 即可誘導出芽，再用生根培養基，誘導出根就可煉苗和栽培，這有利于節約生長時間和生長空間，降低育苗成本，有一定商業價值。

2）觀察完整的組織培養的過程,可將8 組的愈傷培養至第18 d 時,轉至誘芽培養基上進行芽的誘導,待芽長成一定大小,轉至生根培養基上進行根的誘導,再依次進行煉苗和栽培。

3.4 結論 愈傷組織誘導的激素濃度最優組合為6-芐基嘌呤（6-BA）為3 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.2 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L；芽誘導的激素濃度組合為6-芐基嘌呤（6-BA）為1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。愈傷組織的趨勢最優組合為6-芐基嘌呤（6-BA）為3.0 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L；芽的趨勢最優組合為6-芐基嘌呤（6-BA）為1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）為0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。芽的實驗最優組合與趨勢最優組合吻合。

3.5 進一步實驗 由于愈傷組織的實驗最優組合與趨勢最優組合有一點偏差，需進一步驗證趨勢最優組合，看是否優于實驗最優組合；芽的趨勢最優組合與實驗最優組合完全吻合，不需要驗證。