響應面法優化金針菇液體發酵培養基

陳 敏 ，洪家麗 ，雷雅婷 ，陳嵐彬 ，陳永芳 ，萬旭志 ，龔世禹 ，劉藝琳 ，余曉丹 ，曾 峰 ， 劉 斌 ，3

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002；2.國家菌草工程技術研究中心，福建福州 350002；3.福建農林大學生命科學學院，福建福州 350002）

真菌中含有豐富的生物活性物質，如真菌多糖、多肽、氨基酸、蛋白質、生物堿、萜類化合物、色素類化合物、甾醇，還有核苷類物質、酚、酯類、微量元素和維生素等[1]，是保健產品研究和開發的主要原料之一，其中金針菇以超高的保健價值和營養價值吸引人們的眼球。液體深層發酵是獲得食用菌菌絲體的主要方法，具有液體發酵周期短、工業化生產所需空間小、產量高等優點[2]，比子實體的培植更適合工業化生產。研究發現，從液體發酵獲得金針菇菌絲體中提取的多糖有抗氧化[3-7]、提高免疫力[8-10]、抗腫瘤[5，11]等作用。在臨床試驗中，食藥用菌菌絲體多糖類活性物質無副作用[12]。菌絲體中的多糖含量也明顯高于子實體[13]，同時菌絲體多糖的抗氧化活性也大于子實體多糖[14]。目前，真菌液體發酵的研究主要集中于通過對培養基組成、培養條件的優化來提高菌絲得率及其他代謝產物。果蔬汁中富含維生素、氨基酸和礦物質等，添加到培養基中作為氮和碳的補充來源，不僅有利于促進菌絲體生長，提高營養價值和改善風味，還能極大地降低成本，擴大工業生產。為了進一步提高菌絲體得率，應用響應面分析法，以金針菇菌絲生物量作為優化響應值，通過葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和果蔬汁對液體發酵培養基進行優化，以期為食用菌液體發酵果蔬汁提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金針菇菌株，福建農林大學國家菌草工程技術研究中心提供，每2個月傳代1次，于4℃條件下保藏。

1.1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產品；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司產品；101-3A型烘箱，廣州科域新材料科技有限公司產品；SKY-2102C型立式雙層低溫搖床，上海蘇坤實業有限公司產品；SHZ-D III型循環水真空泵，鞏義市予化儀器有限責任公司產品。

1.1.3 培養基

果蔬汁：胡蘿卜汁與梨汁比例為1∶1；金針菇液體發酵培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，果蔬汁10%（V/V），pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 液體菌種的制備

選取經過活化后的金針菇菌種制備液體菌種。在250 mL的三角瓶中裝入100 mL的液體培養基，使用一次性接種針勾取0.5 cm2大小的菌種接種于瓶中，重復操作接種5～6次，最后用脫脂棉塞封住三角瓶口，調整旋轉式搖床轉速為200 r/min，在25℃的條件下振蕩培養三角瓶7 d，備用。

1.2.2 培養基優化

取第1步中振蕩培養完成的菌種作為一級菌種，使用一次性接種針接種于100 mL的液體培養基中，接種量10%，繼續在200 r/min旋轉式搖床上于25℃的條件下培養7 d，根據響應面分析法中Box-Behnken中心組合設計的原理，采用Design-Expert（Version 8.0.6.1）分析軟件設計進行四因素三水平的響應面分析試驗[15-16]。以菌絲體干質量為考查指標，確定各因素對菌絲體影響的顯著性和液體發酵培養基最佳條件。

金針菇液體發酵試驗因素水平及編碼見表1。

表1 金針菇液體發酵試驗因素水平及編碼/%

1.2.3 測定方法

菌絲生物量：取發酵液在4℃條件下以轉速10 000 r/min離心10min，收集沉淀物，去離子水洗滌3次，置于已稱質量的干凈培養皿上，于真空干燥箱中在60℃條件下烘干至恒質量，稱質量2次差距不超過0.2mg即為菌絲生物量[17]。

2 結果與分析

采用響應面分析法中Box-Behnken設計法，以深層發酵得到的菌絲生物量為指標，對金針菇菌絲體生長過程中液體果蔬培養基的各組分進行優化研究。第4，8，9，11次試驗為中心點試驗，用于考查模型的誤差。其中，第21組菌絲生物量最少，為8.175 mg/mL；第 24組菌絲生物量最多，為21.335mg/mL。

響應面中心組合設計金針菇發酵試驗及結果見表2。

表2 響應面中心組合設計金針菇發酵試驗及結果

2.1 金針菇菌絲生物量方差分析結果

采用 Design-Expert（Version 8.0.6.1） 分析軟件對表2中金針菇菌絲生物量的各項數據進行多項式擬合回歸，建立四元二次響應面回歸模型：

金針菇發酵菌絲生物量方差分析結果見表3。

表3 金針菇發酵菌絲生物量方差分析結果

由表3可知，回歸項中p＜0.001，說明所選擇模型非常顯著。失擬項p=0.193 1＞0.05，說明失擬項差異并不顯著，表明該二次回歸模型能夠較顯著擬合葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和果蔬汁質量分數對菌絲生物量的影響，該模型可替代試驗真實點對試驗結果進行分析。其中，模型一次項蛋白胨和果蔬汁質量分數對菌絲生物量影響十分顯著，葡萄糖和KH2PO4質量分數對菌絲生物量影響顯著；模型二次項葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4質量分數對菌絲生物量影響十分顯著，果蔬汁質量分數對菌絲生物量影響顯著。

2.2 金針菇菌絲生物量響應面分析結果

對葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、KH2PO4（C）、果蔬汁（D）4個因素進行交互作用分析。

各因素對金針菇菌絲生物量影響三維響應曲面見圖1。

從圖1可以非常直觀地看出，各因素對響應值的影響，隨著葡萄糖、蛋白胨和果蔬汁質量分數的增加，金針菇菌絲生物量也在增加。葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、KH2PO4（C）、果蔬汁（D） 4個因素之間兩兩相互作用等高線均為橢圓，說明這4個因素兩兩之間交互作用明顯。

圖1 各因素對金針菇菌絲生物量影響三維響應曲面

2.3 驗證試驗

金針菇深層液體發酵試驗中，最優培養基質量分數為葡萄糖2.15%，蛋白胨0.38%，KH2PO40.27%，果蔬汁12.90%；在此條件下，優化后的培養基中菌絲體實際含量為21.46mg/mL，與預測值21.51mg/mL相近，說明預測值和實際值有較高的擬合性，工藝參數準確可靠。

3 結論

深層液體發酵是近年來生產食用菌菌絲體的主要方法之一，已經成為研究食用菌保健制品的重要手段，因此食用菌的開發利用已經由以往的大棚子實體栽培慢慢向深層發酵培養發展，為食藥用菌的研發帶來巨大利益和便利[18]。為了提高液體發酵金針菇菌絲體的得率，通常對液體發酵培養基進行優化，目前食藥用菌液體深層發酵培養基提高菌絲體得率的優化主要集中在氮源、碳源、無機鹽、溫度、pH值等方面[19-20]。試驗以葡萄糖作為碳源，蛋白胨作為氮源，對培養基進行優化，同時添加經濟易得的果蔬汁來發酵食用菌，利用響應面優化培養基配方以研究對菌絲體得率的影響。通過分析，得出最優培養基配方為葡萄糖質量分數2.15%，蛋白胨質量分數0.38%，KH2PO4質量分數0.27%，果蔬汁質量分數12.9%。依據響應面分析調整培養基配方后實際測定值為21.46mg/mL，與預測值相近，說明預測值和實際值有較高的擬合性，工藝參數準確可靠。

通過對金針菇菌絲營養特性的研究可以明顯發現，速效性和遲效性的碳源或氮源，以及無機鹽和維生素等都會對菌絲生物量產生影響。國內在金針菇的液體發酵培養基中通常選擇添加黃豆粉、可溶性淀粉[21]等直接補充基礎的碳源和氮源。果蔬汁中富含單糖、礦物質和VC等均易被人體吸收[22]，可以在保證金針菇生長所需的碳源和氮源的同時進一步提供各類其他營養素，促進菌絲體的生長。同時，深層液體發酵后的果蔬汁培養基中富含氨基酸、多糖、無機酸等多種活性成分，不僅風味獨特，而且營養價值更高，可以后續開發利用，在批量化生產食用保健品中占有很大優勢。

[1]WeiZhenhua，Duan Yingyi，Qian Yongqing，etal.Screening of Ganoderma strainswith high polysaccharides and ganoderic acid contents and optimization of the fermentation medium by statisticalmethods[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2014，37（9）：1 789-1 797.

[2]王麗紅，孔陽，馬衛紅，等.姬松茸菌絲體深層液體發酵條件的優化 [J].陜西科技大學學報，2013，31（3）：97-101.

[3]黃瓊，黃曉梅，張平，等.金針菇多糖的抗氧化活性 [J].食品研究與開發，2014（4）：66-69.

[4]Lin L，Cui F，Zhang J，et al.Antioxidative and renoprotective effects of residue polysaccharides from Flammulina velutipes[J].Carbohydrate Polymers，2016 （6）：388-396.

[5]YangW，Pei F，ShiY，etal.Purification，characterization and anti-proliferation activity of polysaccharides from Flammulina velutipes[J].Carbohydrate Polymers，2012 （2）：474-480.

[6]Liu F，Ooi V E，Chang S T.Free radical scavenging activities ofmushroom polysaccharide extracts[J].Life Sciences，1997，60 （10）：763-771.

[7]Lin G L，Xu X S，Lian W S.Antioxidant activity of edible mushroom polysaccharideextracts in vitro[J].JournalofEast China University of Science&Technology，2006，32（3）：278-277.

[8]Ramamoorthy H，Abraham P，Isaac B，et al.Role for NF-κB inflammatory signalling pathway in tenofovir disoproxil fumarate（TDF） induced renal damage in rats[J].Food&Chemical Toxicology，2016 （3）：103-107.

[9]Yu Q，Nie S P，Wang JQ，et al.Polysaccharide from Ganoderma atrum induces tumor necrosis factor-αsecretion via phosphoinositide 3-kinase/AKT，mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-κB signaling pathways in RAW264.7 cells[J].International Immunopharmacology，2012，14 （4）：362-368.

[10]Yu Q，Nie S P，Wang JQ，et al.Toll-like receptor 4-mediated ROS signaling pathway involved in Ganoderma atrum polysaccharide-induced tumor necrosis factor-α secretion duringmacrophage activation[J].Food&Chemical Toxicology，2014（2）：14-18.

[11]Ouyang F，Wang G，GuoW，etal.AKT signalling andmitochondrial pathways are involved in mushroom polysaccharide-induced apoptosis and G1 or S phase arrest in human hepatoma cells[J].Food Chemistry，2013 （4）：2 130-2 139.

[12]孫培龍，宣以巍，裘娟萍.灰樹花菌絲體發酵及成分分析 [J].食用菌，2001（5）：4-5.

[13]趙永勛.食藥用菌液體發酵的現狀和展望 [J].農業與技術，2004，24（3）：111-114.

[14]冮潔，王賽男，季旭穎.食用菌子實體和菌絲體多糖抗氧化性的比較研究 [J].大連民族大學學報，2015，17（1）：19-23.

[15]何軒輝，廖森泰，劉吉平，等.應用Box-Behnken組合設計優化灰樹花粗多糖提取條件 [J].食用菌學報，2008，15 （3）：64-67.

[16]Chehreghani S，Noaparast M，Rezai B，et al.Bondedparticlemodel calibration using response surfacemethodology[J].Particuology，2017（3）：141-152.

[17]陳瀟筱，楊焱，崔鳳杰，等.添加氧化鋁對灰樹花菌絲體生長及多糖產量的影響 [J].食用菌學報，2016，23（1）：42-46.

[18]韋朝陽，賀亮，邵雙雙，等.外源添加物對食藥用菌液體發酵影響的研究進展 [J].食品科學，2015，36（7）：245-250.

[19]Wu Zhongwei，Lu Junwen，Wang Xiaoqing，et al.Optimization for production of exopolysaccharideswith antitumor activity in vitro from Paecilomyces hepiali[J].Carbohydrate Polymers，2014 （1）：226-234.

[20]Tang Jiapeng，Liu Yiting，Zhu Li.Optimization of fermentation conditions and puriication of cordycepin from Cordyceps militaris[J].Preparative Biochemistry and Biotechnology，2014，44 （1）：90-106.

[21]姜寧，劉曉鵬，楊洪，等.金針菇液體培養基優化研究 [J].安徽農業科學，2007，35（21）：6 429-6 430.

[22]黃勇.淺談果蔬汁的營養生理意義 [J].普洱學院學報，1994 （2）：88-91.◇