煙草懸浮細胞系的構建

孔 瓊，袁盛勇，肖亞楠，楊文超，陳俊梅，蔣雙番，史艷春，楊 升

(紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自 661100)

煙草(NicotianatabacumL.)為茄科煙草屬的一年生草本植物，已成為當前生物學研究最為深入的模式植物材料，尤其在植物分子生物學、基因組學等方面應用最為廣泛。植物懸浮細胞因具有均一性好、條件易控制、培養周期短、重復性好等優點，已廣泛應用于細胞學、發育生物學、遺傳學等研究中[1]。因此，建立穩定且活性高的煙草懸浮細胞作為試驗材料，是開展后期試驗的重要保證之一。植物懸浮細胞的建立受很多因素的影響，其中愈傷組織的成功獲得和單細胞形成是兩個重要環節，同時激素種類及濃度、接種量、蔗糖濃度、轉速等也是關鍵影響因素[2-3]。本研究以煙草的幼嫩莖髓為試驗材料，進行愈傷組織誘導和繼代培養，并進行懸浮細胞培養，分析不同營養條件和培養條件對細胞懸浮系培養的影響，從而建立煙草懸浮細胞系的培養方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以煙草BY-2品種為試驗材料，煙草種子由昆明學院楊紅玉教師惠贈。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導及繼代培養 將煙草幼莖切成1 cm長段，用70%乙醇消毒30 s后，再轉入5%次氯酸鈉中消毒 7 min，無菌水漂洗4～5次后用無菌濾紙吸干水分，切取莖髓，轉入9種愈傷組織誘導培養基中，基本配方為MS+30 mg/L 蔗糖+14 mg/L瓊脂，具體激素配比見表1。于 26 ℃ 暗培養3周，觀察并記錄愈傷組織的生長狀況，統計出愈率和鮮質量。計算公式：接種量=接種后瓶質量(g/皿)-接種前瓶質量(g/皿)；愈傷組織鮮質量=收獲量(g/皿)-接種量(g/皿)；出愈率=(誘導出愈傷組織外植體數/接種的外植體總數)×100%。

綜合比較9種培養基上愈傷組織的生長速度、出愈率、鮮質量、形狀、分散性、顏色等指標，篩選出誘導愈傷組織生長的最佳配方，并將其配方作為愈傷組織繼代和懸浮培養的配方。

1.2.2 懸浮細胞系的建立

1.2.2.1 不同接種量對懸浮細胞生長的影響 選取白色疏松的愈傷組織1、2、3、4 g分別接種于150 mL液體培養基(“1.2.1”節中的配方)中，于26 ℃、140 r/min搖床振蕩暗培養8 d后測定細胞鮮質量，3次重復。

1.2.2.2 蔗糖濃度對懸浮細胞生長的影響 將“1.2.2.1”節中最佳接種量培養10 d后的20 mL懸浮細胞轉接到含有10、20、30、40、50 g/L蔗糖的130 mL新鮮液體培養基(“1.2.1”節中的配方)中，3次重復，于26 ℃、140 r/min搖床振蕩暗培養8 d后測定細胞鮮質量。

1.2.2.3 轉速對懸浮細胞生長的影響 選用“1.2.2.1”節和“1.2.2.2”節篩選出的最佳接種量和蔗糖濃度，制成液體培養基，分別于100、110、120、130、140、150 r/min的恒溫搖床上于26 ℃振蕩暗培養8 d后測定細胞鮮質量，3次重復。

1.2.3 懸浮細胞生長曲線、活性變化及pH值變化 根據“1.2.2.1”節、“1.2.2.2”節和“1.2.2.3”節篩選出的最佳結果，將懸浮細胞于26 ℃振蕩培養12 d，每隔2 d取樣測定細胞鮮質量、pH值和細胞活性，確定其生長周期。

1.2.4 數值測定

1.2.4.1 細胞鮮質量 根據李建安等介紹的方法[4]，具體操作：取充分混勻懸浮細胞8 mL，注入預先稱質量的10 mL離心管中，在3 500 r/min下離心10 min，吸去上清液，室溫下敞口自然風干24 h后稱質量，減去空管質量即為8 mL懸浮細胞的鮮質量。

1.2.4.2 細胞活性測定 按照孔瓊等介紹的方法[5]進行。即將0.2 g細胞加入3 mL 0.6% TTC溶液(用50 mmol/L pH值 7.5 磷酸緩沖液配制，內含0.05% Tween-20)，26 ℃暗培養24 h，3 500 r/min離心10 min，細胞轉入大試管中后加入95%乙醇5 mL，80 ℃水浴20 min，冷卻后3 500 r/min離心 10 min，取上清液于485 nm進行比色。

2 結果與分析

2.1 煙草BY-2愈傷組織誘導

為了研究不同激素組合對煙草BY-2愈傷組織誘導的影響，分別對不同誘導培養基中愈傷組織的生長情況進行觀察分析。結果顯示，8種激素配比的培養基均可誘導煙草莖髓長出愈傷組織，但愈傷組織產生的數量和性狀之間存在明顯差異(表1)。其中配方1、2和3中莖髓培養第3天時，莖髓邊緣開始膨脹變大；7 d時，切口兩端開始愈傷化，邊緣產生肉眼可見的乳白色顆粒狀愈傷組織；21 d后，出現結構疏松、生長旺盛的白色愈傷組織。但配方3中的愈傷組織獲得量和顏色質地顯著高于配方1、2中的誘導結果，出愈率高達 93.3%。而配方4未明顯獲得愈傷組織。配方5和7中獲得的愈傷組織生長緩慢，伴有褐化現象。配方6、8和9中的愈傷組織生長緩慢，質地致密。因此，在誘導煙草BY-2愈傷組織過程中，激素2，4-D和6-BA配合使用比NAA、2，4-D和6-BA混合使用更能有效地促進愈傷組織產生和生長，且配方3(MS+3.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA)為誘導煙草BY-2愈傷組織生長的最佳配方。

表1 不同植物激素組合對煙草BY-2愈傷組織的誘導情況

注：采用最小顯著差數法(LSD)評價差異顯著性，表中數值為“平均值±標準誤”，不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。表2同。

2.2 懸浮細胞系構建

2.2.1 不同接種量對懸浮細胞生長的影響 初始接種量對懸浮細胞系的生長有著明顯影響，細胞需要達到一定的起始密度才能進行生長，但濃度過大又需要消耗大量的養分。因此，選擇適宜的接種量是懸浮細胞培養過程中一個重要的因素。不同接種量對煙草懸浮細胞生長量具有較大影響。由圖1可見，在150 mL液體培養基中，當初始接種量為1、2 g時，煙草懸浮細胞生長速度較慢，顯著低于3 g和4 g的初始接種量；初始接種量為3 g時，懸浮細胞生長速度快，第8天后，8 mL 細胞鮮質量高達(0.727 3±0.003 8)g。

2.2.2 蔗糖濃度對懸浮細胞生長的影響 碳源是植物組織培養中的必需營養因子，同時也參與了滲透壓的平衡調節，因此起著十分重要的作用。蔗糖濃度對煙草懸浮細胞鮮質量增加的影響如圖2所示。當蔗糖濃度為1%、2%時，煙草細胞增殖不明顯且差異不顯著；而蔗糖濃度為3%、4%、5%時，細胞增殖較快，且差異顯著，尤其是濃度為3%時，細胞增殖最快，顯著高于其他處理。

2.2.3 轉速對懸浮細胞生長的影響 不同的轉速對懸浮細胞的分散性、長勢和貼壁現象具有較大的影響。在最佳接種量和蔗糖濃度下，轉速對懸浮細胞生長也有不同的影響，過高或過低均不利于細胞生長。當轉速為l10～120 r/min時，細胞生長緩慢，細胞鮮質量增加不明顯，細胞分散性差，容易在短時間內形成較大的細胞團；轉速為130～140 r/min時，細胞生長較快，分散性好，且140 r/min時細胞生長最快，培養8 d后8 mL細胞鮮質量高達(0.639 5±0.009 4)g，鮮質量高于其他處理；而當轉速高達150 r/min時，細胞增長量有所下降，且易出現污染問題，貼壁死細胞較多(表2)。因此適宜煙草懸浮細胞培養的轉速為140 r/min，有利于細胞生長。

2.2.4 煙草BY-2懸浮細胞系的生長曲線、pH值及活性變化 在優化后的培養條件下，測定了煙草懸浮細胞培養過程中細胞鮮質量和pH值變化，并繪制了其生長曲線。在培養過程中，細胞生長量近“S”形規律，鮮質量變化趨勢明顯，且與活性變化密切相關，而培養液中pH值呈下降趨勢(圖3和圖4)。延遲期(1～2d)和對數期(3～10d)明顯，且在對數期時，細胞增殖明顯，當培養到10 d時，細胞鮮質量達到最大值。根據不同培養時間下細胞活性測定結果，發現細胞活性變化與生長量變化相似，且在培養8 d時達到最高值，活性最好。因此結合細胞生長量變化，煙草懸浮細胞的繼代周期為8 d。

表2 轉速對懸浮細胞鮮質量的影響

3 結論與討論

在植物懸浮細胞培養過程中，激素是愈傷組織誘導和懸浮細胞構建的關鍵因素之一，不同激素種類和濃度配比后，其相互作用可影響其形態建成方向[4-6]。研究發現添加一定濃度的2，4-D和6-BA對愈傷組織誘導具有很大的促進作用，且2，4-D是禾谷類植物產生愈傷組織所必需的生長物質[7-8]。本研究在煙草愈傷組織誘導過程中也發現2，4-D和6-BA配比后的重要作用，且最佳誘導配比為3.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA。因此，合適的激素種類和濃度配比是愈傷組織獲取和改善狀態的重要前提。

初始接種量和蔗糖的多少對懸浮細胞系建立也起著重要作用。大多數懸浮細胞的生長具有群聚效應，細胞密度過低或過高都不利于懸浮細胞系的建立，而合適的密度才能促進細胞快速生長，細胞分散性好[9]。在小麥懸浮細胞系建立過程中發現，初始接種量為0.5～1.5 g(每400 mL培養液)時，細胞增殖倍數隨著接種量的增加而增加，且接種量為1.5 g時達到最大值，此時細胞系分散性好，顏色鮮艷，如接種量增加，細胞增殖倍數呈下降趨勢，培養液顏色渾濁[10]。同樣的現象也在草莓懸浮細胞系建立試驗中發現[11]。蔗糖濃度過低，培養物不僅得不到碳源補充，還會發生營養物質外滲，而過高則會出現生理性缺水，兩種情況最終都會導致細胞死亡[12]。大量試驗結果表明，一般懸浮細胞的培養過程中蔗糖濃度一般為20～30 g/L。因此，煙草懸浮細胞系構建的最佳初始接種量為3 g/150 mL，蔗糖濃度為30 g/L。

前人在研究煙草懸浮細胞系構建過程中發現，不同轉速對細胞長勢、分散性和貼壁現象具有較大影響[13]。同樣的現象也表現于本試驗中，當轉速較低(110～120 r/min)時，懸浮培養基中的氧含量較低，細胞生長速度較慢，機械力較小，分散性較差，易結成團；而當轉速較高(150 r/min)時，可能易發生機械損傷，死細胞較多。因此合適的轉速也是懸浮細胞成功構建的關鍵因子。

[1]吳春霞.植物細胞懸浮培養的影響因素[J].安徽農業科學，2009，37(1)：36-38.

[2]周仕順，陶志章.煙草的組織培養[J].云南農業科技，2005，24(1)：28-29.

[3]李忠光，楊仕忠，周 滔.煙草懸浮培養細胞的建立及其對機械刺激的敏感性研究[J].云南師范大學學報，2005，25(6)：43-45.

[4]李建安，胡芳名.擬南芥懸浮細胞生長特性及其繼代培養條件[J].經濟林研究，2006，4(1)：26-29.

[5]孔 瓊，張 燕，張華茗，等.擬南芥懸浮細胞系的建立[J].西部林業科學，2011，40(4)：12-16.

[6]謝從華，柳 俊.植物細胞工程[M].北京：高等教育出版社，2004：130-131.

[7]邢登輝，吳琴生，劉大鈞.禾谷類作物細胞培養[J].生物學通報，1994，29(7)：1-3.

[8]王睿輝，陳耀鋒，高秀武，等.激素對小麥幼胚胚性無性系高頻率誘導的影響[J].西北農林科技大學學報，2001，29(1)：33-36.

[9]張 瑜，楊知建，張志揚，等.不同濃度激素對野生細葉結縷草愈傷組織的誘導與分化的影響[J].生物技術通報，2007(2)：143-146.

[10]陳 琰.不同抗葉銹小麥品種懸浮細胞系的建立[D].保定：河北農業大學，2005：16.

[11]周春江，李衛東，葛會波.草莓懸浮細咆系的建立及某些影響因素[J].植物生理學報，2002，38(1)：22-24.

[12]鄒洪波.擬南芥懸浮細胞系建立及硒對擬南芥生長的影響[D].長沙：湖南大學，2007：18-19.

[13]王 榮.疫霉菌激發子parasiticein誘導煙草細胞凋亡及發生機制研究[D].泰安：山東農業大學，2007：30-31.