內生假單胞菌對小麥生長及光合特性的影響

龐發虎，黃思良，趙晨晨

(1.南陽師范學院農業工程學院，河南南陽 473061；2.南水北調中線水源區水安全河南省協調創新中心/河南省南水北調中線水源區生態安全重點實驗室，河南南陽 473061)

內生菌是指生活在健康的植物體內，對植物沒有引起明顯病害癥狀的微生物。內生菌在長期的適應過程中與宿主植物協同進化，建立了互惠和諧的共生關系，已成為國內外研究的熱點[1]。內生菌產生的代謝物質能刺激植物的生長和發育，而植物能為內生菌提供光合產物和礦物質并通過種子幫助其傳播[2-3]。有關內生菌影響宿主植物的光合作用已有一些報道，如Richardson等用內生菌處理2種不同基因型的牛毛草后，發現其凈光合速率之間確實存在著差異[4]；沈德龍等研究發現用內生成團泛菌PantoeaagglomeransYS19接種水稻后可明顯提高水稻旗葉乳熟期的光合速率[5]。史應武從甜菜根中分離出1株多黏類芽孢桿菌S7，用該菌接種甜菜后可使葉片的凈光合速率提高16.11%[6]。

目前對植物光合作用的研究多集中在非生物因素，而對于生物因子，尤其是植物內生菌對宿主植物光合特征的影響研究較少。Larran等都對小麥的內生菌進行分離鑒定[7-9]，但有關小麥內生細菌對小麥的光合特性及產量的影響，國內外還鮮有報道。因此本研究用內生假單胞菌JD204接種不同品種小麥后，分析內生假單胞菌對小麥的生長及光合特性的影響，探討內生假單胞菌影響光合參數的機制，揭示小麥內生假單胞菌與產量的關系，以期為促進小麥的生長和發育提供參考依據，為防病增產的新型生物有機肥料開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試品種 供試的14個小麥品種(新源958、豫農416、豫麥130、金豐3號、矮優66、豫麥69、中育12、高優503、偃高006、鄭麥9023、開麥20、眾連1號、濮麥9號和矮抗噸產王)購自河南省南陽市種子公司。

1.1.2 供試菌株 菌株為小麥分蘗期分離自根部的1株內生惡臭假單胞菌JD204，并對其進行了抗藥性標記，獲得抗藥性突變株JD204M，保存于南陽師范學院植物病理學實驗室。

1.1.3 內生假單胞菌懸浮液的制備 將抗藥突變株JD204M在NA平板上活化后，挑取2～3個環接種于NB培養基中，在160 r/min、30 ℃搖床上培養24 h，然后調菌體懸浮液濃度為107CFU/mL備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 于2014年10月上旬用抗藥性變異株JD204M的菌體懸浮液(107CFU/mL)分別浸泡14個小麥品種種子，1 mL菌體懸浮液浸泡4 g小麥種子，浸泡24 h后分別播種于南陽國家農業科技示范園區試驗地(112°27′49″E、32°57′6″N)中，麥地常規深耕碎土，整理平整。施肥量為 750 kg/hm2復合肥(18% N，18% P2O5，9% K2O)。試驗采用隨機區組設計，共28個處理，每處理重復3次，每處理面積為2 m×2 m(播種量80 g)，每個處理播種8行，以純NB培養液浸泡麥種為對照。

1.2.2 分蘗數的調查和株高的測定 在分蘗期對田間小麥分蘗數進行調查，用直尺測量小麥株高。每小區采用5點調查法，每點調查20株，取其平均值。每個處理重復3次。

1.2.3 根系活力和葉綠素含量的測定 參照張志良等的方法[10]進行。

1.2.4 光合參數的測定 2015年5月上旬，于晴天上午 09：00—11：00進行測定。采用TPS-1便攜式光合儀，對JD204M處理區和對照區小麥光合參數凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)進行測定[11]。每處理選擇長勢一致的小麥苗，每株測定葉齡相對一致的成熟頂生葉片，每個處理至少測定6次重復。

1.2.5 熒光參數的測定 采用Imaging-PAM熒光儀(Heinz Walz GmbH，Germany)于5月上旬晴天上午09：00—11：00進行測定。選取生長良好的葉片暗適應20 min后測定初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)；在光適應(5 min)下測定Fm′、Fo′及Fs等熒光參數。根據測得的熒光參數計算：光系統Ⅱ最大光化學效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm；PSⅡ實際光化學效率：ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′。每個處理分別測定8次。

1.3 數據處理

采用Excel 2007進行數據處理，用SPSS 17.0軟件進行方差分析和多重比較(LSD法，α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 JD204M對小麥分蘗數的影響

從表1可以看出，用內生假單胞菌變異株JD204M處理小麥種子后能提高小麥植株的分蘗數。不同小麥品種提高幅度各異，其分蘗數雖高于各自的對照，但兩者之間差異不顯著。在14個品種中，鄭麥9023分蘗數增加最多，比對照提高34.15%，其次為豫農416和矮優66，分別比對照增加27.91%、27.27%；中育12內生菌處理后與對照相比幾乎無變化。

表1 內生細菌JD204M處理對小麥植株分蘗數、株高和根系活力的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下表同。

2.2 JD204M對小麥株高的影響

試驗結果(表1)表明，用內生菌變異株JD204M處理后對不同品種小麥株高的影響各異。14個品種中，有12個(豫農416、金豐3號、中育12、濮麥9號、鄭麥9023、開麥20、矮優66、新源958、豫麥130、豫麥69、偃高006和矮抗噸產王)株高比對照增加了2.91%～40.58%(平均11.73%)，2個品種(眾連1號和高優503)分別比對照降低2.60%和2.24%。矮優66、濮麥9號、鄭麥9023、豫麥69和豫麥130小麥株高與各自的對照相比在0.05水平上達到顯著差異。

2.3 JD204M對小麥植株根系活力的影響

表1的結果顯示，JD204M對不同小麥植株根系活力的影響有差異。4個JD204M處理的小麥品種(濮麥9號、豫農416、偃高006和豫麥130)植株的根系活力與各自對照相比差異顯著。12個小麥品種(矮優66、高優503、中育12、濮麥9號、鄭麥9023、開麥20、豫農416、新源958、豫麥69、偃高006、豫麥130和眾連1號)的根系活力比對照增加4.18%～26.96%(平均13.81%)，金豐3號和矮抗噸產王根系活力分別比對照降低8.54%和7.58%。

2.4 JD204M對小麥葉片葉綠素含量的影響

由表2可以看出，用內生菌變異株JD204M處理后有4個品種(中育12、金豐3號、豫麥69和眾連1號)小麥葉片的葉綠素a含量分別小于各自的對照，7個品種(中育12、新源958、偃高006、金豐3號、鄭麥9023、眾連1號、矮優66)與對照之間具有顯著性差異；有3個品種(金豐3號、眾連1號、豫麥69)葉綠素b含量小于對照，8個品種(開麥20、新源958、偃高006、金豐3號、豫麥130、鄭麥9023、眾連1號和矮抗噸產王)與對照之間差異顯著；有4個品種(中育12、金豐3號、豫麥69和眾連1號)總的葉綠素含量小于對照，除了高優503、開麥20、豫農416外其余品種與對照之間都具有顯著性差異。10個品種小麥葉片總葉綠素含量比對照增加3.24%～12.78%(平均7.64%)。

表2 JD204M對小麥植株葉片葉綠素含量的影響

2.5 JD204M對小麥葉片光合特性的影響

2.5.1 JD204M對小麥葉片凈光合速率(Pn)的影響 由表3可以看出，接種JD204M后有4個品種(中育12、金豐3號、豫麥69和眾連1號)的Pn與對照相比有所降低，其余10個品種(高優503、新源958、偃高006、開麥20、豫麥130、豫農416、鄭麥9023、濮麥9號、矮抗噸產王、矮優66)的Pn與對照相比分別增加了20.69%、25.95%、22.82%、16.41%、20.51%、3.33%、14.01%、7.39%、9.20%和21.44%，表明內生假單胞菌可以提高多個小麥品種的光合速率，增強光合活性，有利于葉片對光能的吸收。經過統計分析，中育12、新源958、偃高006這3個品種與對照間具有顯著性差異。

2.5.2 JD204M對小麥葉片蒸騰速率(Tr)的影響 由表3可知，用JD204M處理后3個品種(中育12、豫麥69和眾連1號)小麥葉片的Tr小于對照，其余11個小麥品種葉片的Tr比對照增加0.41%～20.56%(平均10.74%)，2個品種(新源958和開麥20)小麥葉片的Tr與對照相比差異顯著，表明小麥接種內生菌后能提高葉片的Tr。

2.5.3 JD204M對小麥葉片氣孔導度(Gs)的影響 試驗結果(表3)表明，用JD204M處理后3個品種(中育12、豫麥69和眾連1號)小麥葉片的Gs小于對照，11個小麥品種葉片的Gs比對照增加3.63%～42.33%(平均20.79%)，5個品種(中育12、新源958、偃高006、豫麥130、豫農416)接種內生菌后葉片的Gs與對照相比具有顯著性差異，表明內生菌可提高多個小麥品種葉片的Gs，有利于CO2氣體的交換和光合速率的增加。

2.5.4 JD204M對小麥葉片胞間CO2濃度(Ci)的影響 由表3可以看出，用JD204M處理后，中育12、金豐3號、豫農416、豫麥69和眾連1號品種小麥葉片的Ci高于對照，其余9個品種(高優503、新原958、偃高006、開麥20、豫麥130、鄭麥9023、濮麥9號、矮抗噸產王和矮優66)葉片Ci分別比對照降低了9.16%、16.88%、15.31%、13.93%、20.78%、18.96%、8.96%、9.33%和8.71%；新源958、金豐3號、開麥20、豫麥130和鄭麥9023接種JD204M后Ci與對照間差異顯著。

2.6 JD204M對小麥葉片熒光特性的影響

2.6.1 JD204M對小麥葉片Fv/Fm的影響Fv/Fm值一般是在葉片暗適應20 min后測得，反映經充分暗適應小麥葉片PSⅡ的最大光化學效率，常作為度量植物葉片PSⅡ原初光能轉換效率及PSⅡ潛在活性的指標[12]。由表4可以看出，用JD204M接種后，不同小麥品種間Fv/Fm值變化有所差異。除金豐3號、豫麥69和眾連1號外，其余小麥品種葉片的Fv/Fm值與對照相比均有所增加，但增加的幅度變化不大，且與對照間均無顯著性差異。

表3 JD204M對小麥植株光合特性的影響

2.6.2 JD204M對小麥實際光化學效率(ΦPSⅡ)的影響ΦPSⅡ是PSⅡ實際光化學效率，指光合電子傳遞的能量占吸收光能的比例，反映了在光照條件下PSⅡ反應中心部分關閉的情況下的實際原初光能捕獲效率[13]。由表4可知，用JD204M處理后12個小麥品種(矮優66、高優503、中育12、濮麥9號、鄭麥9023、開麥20、豫農416、新原958、矮抗噸產王、偃高006、豫麥130和眾連1號)的實際光化學效率(ΦPSⅡ)與對照相比均有所提高，其中矮抗噸產王和新原958小麥葉片實際光化學效率(ΦPSⅡ)分別比對照增加24.23%和22.20%，達到顯著差異，其余品種與對照間均無顯著性差異。

2.6.3 JD204M對小麥Fv/Fo的影響Fv/Fo值反映PSⅡ的潛在活性。由表4可以看出，用JD204M處理后3個品種(金豐3號、豫麥69和眾連1號)小麥葉片的Fv/Fo與對照相比降低，11個品種(中育12、高優503、新原958、偃高006、開麥20、豫麥130、豫農416、鄭麥9023、濮麥9號、矮抗噸產王和矮優66)小麥葉片的Fv/Fo與對照相比分別增加了18.46%、10.63%、14.26%、21.83%、23.50%、18.68%、28.08%、3.79%、21.98%、27.50%和25.47%，但均無顯著性差異。

3 討論

葉綠素含量的高低與小麥產量密切相關。莫瑤等研究發現，接種固氮菌對4個不同甘蔗品種的葉綠素含量提高均有一定的促進作用，且不同品種之間有差異[14-15]。用內生細菌yc8接種后，不同油菜品種的葉綠素含量均有一定程度的提高[16]。本研究結果表明，用JD204M處理后，10個品種小麥葉片的葉綠素a含量高于對照，11個品種葉綠素b含量高于對照，10個品種總葉綠素含量比對照增加 3.24%～12.78%(平均7.64%)。有研究認為葉綠素a有利于吸收長波光，葉綠素b有利于吸收短波光，當葉綠素a/葉綠素b值減少時，能提高葉片光合活性[17]。本研究得出凡是葉綠素a/葉綠素b值小于對照的品種，其小麥產量都高于對照，這與周竹青等研究認為高產小麥品種的總葉綠素含量維持在較高水平，葉綠素a/葉綠素b相對較低，說明該類型品種有較強的光能利用率的研究結果[18]相一致。但也有一些品種與趙昕等研究認為接種AM真菌后，喜樹葉片葉綠素a/葉綠素b顯著高于無菌根幼苗的結果[19]相一致，這可能與不同的微生物對光合色素的化學特性影響以及不同植物對光強的響應不同有關。

光合參數在一定程度上能很好地反映小麥的抗逆性程度。尤揚等認為胞間CO2濃度(Ci)與光合速率呈負相關[20]。王金龍等對黑麥草研究發現，內生真菌的感染對其宿主植物的蒸騰速率、光合速率以及生物量都有顯著影響[21]。

表4 JD204M處理對小麥葉片熒光特性的影響

本研究結果表明，小麥在接種內生假單胞菌JD204M后，不同品種小麥葉片的Pn、Ci、Gs和Tr與各自對照相比，其變化的趨勢和幅度有所差異，可能與參與這些光合參數調控的特定基因表達有關，具體的分子機理還待于進一步研究。本試驗研究也得出有10個小麥品種的Pn明顯高于對照，這可能是在光合作用過程中Ci、Gs和Tr等因子共同協調、相互作用的結果，這與吳凱朝等對甘蔗的研究結果[22]相一致。由于內生假單胞菌JD204M在小麥體內能夠很好定植，在小麥的生長發育過程中調控著小麥體內的微環境，從而對小麥葉片表面氣孔的開閉和體內水分與其他養分的運輸起到調節作用，進而影響著小麥的光合作用；另一方面由于該菌可以固氮和利用鐵銨鹽(數據未顯示)，為小麥的生長發育提供所需的氮素和鐵素營養，從而有利于光合作用的提高。本研究結果還表明，內生假單胞菌JD204M對不同品種小麥間的光合生理效應存在差異，這可能與內生假單胞菌與小麥的基因互作和適應性有關，具體原因還有待于進一步探討和研究。

前人研究表明，Fv/Fm、ΦPSⅡ、Fv/Fo等葉綠素熒光參數與光合作用的各個反應過程密切相關，其特性極易受環境條件的變化而變化，能很好地反映植物的抗逆性程度，常用來作為測定植物葉片光合功能受逆程度的探針[23]。本試驗結果表明，用內生假單胞菌JD204M處理后，不同小麥品種的葉綠素熒光參數表現出差異，有11個品種的Fv/Fm和Fv/Fo、12個品種的ΦPSⅡ與對照相比有所增大，表明內生菌處理后，小麥能很好地適應光照度的變化，提高小麥葉片PSⅡ的實際光化學效率、電子傳遞速率，使小麥對光能的吸收和轉化效率提高，有利于光合作用的增強，這與史應武對甜菜的研究結論[6]相一致。JD204M有固氮功能，推測可通過調節葉綠素熒光參數來提高小麥葉片的凈光合速率，進而提高小麥產量。

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