利用蘋果皮渣發酵制備天然酵素工藝優化及其對蘋果品質的影響

郭俊花，許先猛，馬 欣，王曉東，李賑群

(運城職業技術學院有機食品工程系，山西運城 044000)

微生物酵素是指以1種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等為原料，經多種有益菌發酵而產生，含有豐富微生物、酶、礦物質和次生代謝產物等營養成分的功能性微生物發酵產品[1]。酵素菌是一種微生物，又被稱為農用酵素(BYM)，早在20世紀40年代由日本的島本覺發明，并在農業生產中發揮了重要作用[2]，而酵素菌肥可以改善土壤理化性質，提高土壤供肥能力，又可以抑制有害病菌，促進作物早熟，改善果樹樹體營養，提高水果的產量和質量[3]。目前，對果蔬酵素的研究主要是優化發酵工藝、功能性成分研究等方面[4-7]，且主要強調酵素在食用、保健方面的突出功效，果蔬酵素對種植業的功效研究較少。

蘋果是我國的第一大水果，2016年產量達5 400萬t，占世界總產量的50%以上，其中約有20%用于工業化深加工，每年將產生數以萬噸的蘋果渣，而這些蘋果渣除少量用作燃料、飼料和提取果膠外，大部分被當做垃圾處理，造成資源極大浪費[8]。本試驗以蘋果果脯加工企業生產過程中的下腳料——蘋果皮渣為原料，利用果皮本身含有的天然有益微生物進行蘋果皮渣酵素制備，并將蘋果皮渣酵素運用在有機蘋果的種植過程中，研究酵素對蘋果生長過程果實品質的影響，以提高蘋果皮渣的利用價值，減少巨大的資源浪費，并能為蘋果產業的發展另辟蹊徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 蘋果皮渣，由山西澤源食品有限公司提供。

1.1.2 試劑 純度98%的沒食子酸標準品，由貴州遵義佳宏化工有限公司生產；福林酚試劑、蕓香苷標準品，為美國Sigma公司產品；抗壞血酸標準品，由上海谷研生物化學研究所生產；氫氧化鈉、無水碳酸鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、草酸、2，6-二氯靛酚、碳酸氫鈉、亞鐵氰化鉀、亞甲基藍、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純，市購。

1.1.3 儀器 JJ-2組織搗碎勻漿機，江蘇常州國華電器有限公司生產；JY92-Ⅱ超聲細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司生產；1/1 000 g BSA323S電子分析天平，德國賽多利斯公司生產；3K15高速冷凍離心機，德國Sigma公司生產；FE20K pH計，瑞士梅特勒托利多公司生產；WYT-32ATC手持糖度折光儀，福建泉州儀器有限公司生產；游標卡尺0～150 mm，上海量具刃具廠生產；GY-B硬度計，吉林四平機械設備公司生產；SX2-4-10馬福爐，北京科偉儀器有限公司生產；754紫外分光光度計、722N可見分光光度計，上海菁華儀器有限公司生產；1 000 W萬用電爐，天津泰斯特儀器有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果皮渣酵素發酵工藝 將蘋果皮渣打漿，用超聲波400 W處理10 min；紅糖用紫外線殺菌45 min，用無菌水溶解，置于已滅菌的玻璃瓶中，加入蘋果皮渣，攪拌均勻，用蘋果醋調節發酵液pH值至合適值；封口，放于暗處，15～25 ℃下發酵[9]。

1.2.2 蘋果皮渣酵素發酵的單因素試驗設計

1.2.2.1 蘋果皮渣量 分別取100、200、300、400、500 g蘋果皮渣，打漿，超聲波處理；分別取90 g紅糖溶解于1 000 mL無菌水中，置于已滅菌的玻璃瓶中，并加入蘋果皮渣，攪拌均勻，用蘋果醋調節初始pH值至5.0；封口，放于暗處，15～25 ℃下發酵150 d；測定蘋果皮渣酵素的酵素超氧化物歧化酶(SOD)活性和總酸含量。

1.2.2.2 加糖量 取300 g蘋果皮渣，打漿，超聲波處理；分別取30、60、90、120、150 g紅糖溶解于1 000 mL無菌水中，置于已滅菌的玻璃瓶中，加入蘋果皮渣，攪拌均勻，用蘋果醋調節初始pH值至5.0；封口，放于暗處，15～25 ℃下發酵150 d；測定蘋果皮渣酵素的SOD活性和總酸含量。

1.2.2.3 初始pH值 取300 g蘋果皮渣，打漿，超聲波處理；分別取90 g紅糖溶解于1 000 mL無菌水中，置于已滅菌的玻璃瓶中，加入蘋果皮渣，攪拌均勻，分別用蘋果醋調節初始pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；封口，放于暗處，15～25 ℃下發酵150 d；測定蘋果皮渣酵素的SOD活性和總酸含量。

1.2.2.4 發酵時間 取300 g蘋果皮渣，打漿，超聲波處理；分別取90 g紅糖溶解于1 000 mL無菌水中，置于已滅菌的玻璃瓶中，加入蘋果皮渣，攪拌均勻，分別用蘋果醋調節初始pH值至5.0；封口，放于暗處，15～25 ℃下分別發酵90、120、150、180、210 d；測定蘋果皮渣酵素的SOD活性和總酸含量。

1.2.3 蘋果皮渣酵素發酵正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，以蘋果皮渣添加量、紅糖添加量、初始pH值、發酵時間為自變量因素，以SOD活性和總酸含量為評價指標，進行L9(34)正交試驗，以確定蘋果皮渣酵素的最佳發酵工藝條件(表1)。

表1 蘋果皮渣酵素發酵正交試驗因素水平設計

1.2.4 蘋果皮渣酵素對紅富士蘋果生長過程中果實品質的影響 以山西省運城市臨猗縣孫吉有機果園為試驗點，選擇樹勢均勻一致、果園土壤差異相對較小、栽培措施基本一致的10年生紅富士蘋果樹為試驗對象，選擇10株于當年9月26日，次年3月28日、5月2日分別施入5、2、2 kg/株蘋果渣酵素，另選10株不施蘋果渣酵素作為對照。果樹生長期間不進行其他施肥管理。蘋果生長過程中，測定2個處理的總酸、可溶性固形物含量及固酸比、硬度，6月15日進行第1次采樣，后每隔14 d采樣1次，直至果實成熟，其中蘋果成熟期還另測定果實的單果質量、果形指數、總灰分、維生素C含量、蛋白質含量、還原糖含量、水解后還原糖含量、多酚含量及黃酮含量。每次隨機抽取10個果實，重復3次。

1.2.5 測定方法 分別采用鄰苯三酚自氧化法、福林酚法、硝酸鋁絡合分光光度法測定SOD活性、多酚含量、黃酮含量[10-13]；分別采用手持糖度折光儀、GY-B硬度計、游標卡尺、精度為千分之一的電子天平測定果實可溶性固形物含量、硬度、果實縱徑和橫徑、單果質量；分別參照標準《食品中總酸的測定》(GB/T 12456—2008)、《食品中灰分的測定》(GB 5009.4—2016)、《食品中抗壞血酸的測定》(GB 5009.86—2016)、《食品中蛋白質的測定》(GB 5009.5—2010)、《食品中還原糖的測定》(GB 5009.7—2016)、《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》(GB 5009.8—2008)測定總酸(可滴定酸)含量、總灰分、維生素C含量、蛋白質含量、還原糖含量及水解后還原糖含量。固酸比為可溶性固形物含量與總酸含量的比值，果形指數為果實縱徑和橫徑之比。

2 結果與分析

2.1 蘋果皮渣酵素發酵單因素試驗

2.1.1 蘋果皮渣添加量的確定 蘋果皮表面含有大量的天然微生物菌群，可為酵素發酵提供酵母菌、醋酸菌等必需的微生物。由圖1可見，隨著蘋果皮渣添加量的增加，發酵液中有益微生物數量增加，從而使發酵液中SOD活性和總酸含量均呈上升趨勢；當蘋果皮渣添加量為100～300 g/L時，SOD活性和總酸含量增加相對較快，繼續增加蘋果皮渣量，SOD活性和總酸含量上升趨勢緩慢，故選擇最佳蘋果皮渣添加量為300 g/L。

2.1.2 紅糖添加量的確定 紅糖可為發酵液中的有益菌群提供充足的碳源，使有益生物菌群大量繁殖，并產生大量的代謝產物，考察紅糖添加量可為微生物的生長代謝確定合適的碳源量。由圖2可見，當紅糖添加量為90 g/L時，SOD活性達到最大值，此時總酸含量為3.9 g/L，且隨紅糖添加量的增加，總酸含量變化不大。故選擇最佳加糖量為90 g/L。

2.1.3 初始pH值的確定 將蘋果醋加入到發酵液中，既可以調節發酵液的pH值，使其呈弱酸性，有效抑制有害菌群的繁殖，又可以抑制乙醇的產生，有利于耐酸性酶的產生與活性保持，為有益菌群的大量繁殖提供條件[9]。由圖3可見，初始pH值對酵素的總酸含量和SOD活性有較大影響，初始pH值調至5.0時，二者達到最大值。故確定最佳初始pH值為 5.0。

2.1.4 發酵時間的確定 由圖4可見，發酵前120 d內，由于微生物的大量繁殖代謝，總酸含量和SOD活性有明顯上升，發酵150 d時總酸含量和SOD活性達到最大值，之后隨著發酵時間的延長，微生物代謝活動逐漸減弱，總酸含量和SOD活性略有下降。因此，選擇最適發酵時間為150 d。

2.2 蘋果皮渣酵素發酵正交試驗

由表2可見，影響蘋果皮渣酵素總酸含量的因素主次順序為B>A>D>C，即加糖量對總酸含量有很大影響，是主要控制因素，其次是蘋果添加量，最優發酵組合為B2A3D2C3；影響蘋果皮渣酵素中SOD活性的因素主次順序為B>A>C>D，最優組合也為B2A3D2C3。因此，確定最佳發酵工藝為蘋果皮渣添加量400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH值5.5、發酵時間150 d。經測定，在優化條件下酵素總酸含量為 3.96 g/L，SOD活性為66.2 U/mL。

2.3 蘋果皮渣酵素對富士蘋果品質的影響

2.3.1 蘋果皮渣酵素對富士蘋果生長過程中果實品質的影響

2.3.1.1 可溶性固形物 可溶性固形物含量是果實重要的品質性狀之一，其含量高低對果實營養價值、風味口感、實質產量等方面有重要影響，并對果實儲藏、運輸過程中的防凍等有重要影響[14]。由圖5可知，在生長期間，施入酵素和未施酵素(對照)蘋果果實的可溶性固形物含量呈明顯上升趨勢；對照處理的蘋果可溶性固形物含量低于酵素處理；生長前期，2個處理的可溶性固形物含量相差較小，8月10日后2個處理的果實可溶性固形物含量差距增加，蘋果皮渣酵素的施用明顯提高了蘋果生長后期的可溶性固形物含量，從而明顯改善了蘋果的風味及品質。果實中的酸含量也是影響果實品質的重要因素[14]。

2.3.1.2 總酸含量 由圖6可見，在生長期間，施入酵素的蘋果總酸含量變化趨勢與未施入酵素相似，呈逐漸下降趨勢，同一時期施入酵素的蘋果總酸含量高于對照，說明施入酵素可促進蘋果果實中有機酸的積累；6月15日至7月13日，2個處理的總酸含量緩慢下降，7月27日后總酸含量下降迅速。

表2 蘋果皮渣酵素發酵正交試驗結果

注：k1、k2、k3、R為總酸對應數值；k1′、k2′、k3′、R′為SOD活性對應數值。

2.3.1.3 糖酸比 蘋果的風味品質主要取決于糖酸含量及其配比關系，高糖低酸的果實口感淡薄，低糖高酸的果實口感過酸，都不符合鮮食要求[15]。由圖7可見，施入酵素的蘋果與對照蘋果相比，固酸比差異不大，僅在8月10日至9月21日之間施入酵素的蘋果固酸比稍大，至成熟時二者固酸比又幾乎相同。

2.3.1.4 果實硬度 由圖8可見，施入酵素和未施入酵素(對照)的蘋果硬度均呈先上升后降低趨勢，8月10日二者的硬度達到最大值；生長期間，對照蘋果的硬度均低于酵素處理的蘋果，說明施用酵素可提高蘋果果實的硬度，從而進一步延長蘋果的貨架期。

2.3.2 蘋果皮渣酵素對富士蘋果成熟果實品質的影響 由表3可見，施入酵素的蘋果果形指數低于對照處理，相互間差異不顯著(P>0.05)；除果形指數外，施入酵素的蘋果其他指標均大于對照，其中總灰分、維生素C含量、水解后還原糖含量、果皮中多酚含量、果肉中黃酮含量與對照相比差異不顯著(P>0.05)，單果質量、去皮硬度、總酸含量、蛋白質含量、果肉中多酚含量、果皮中黃酮含量與對照相比差異顯著(P<0.05)，可溶性固形物、還原糖含量與對照相比差異極顯著(P<0.01)。

表3 施入酵素對紅富士蘋果果實品質的影響

注：同列數據后標注“*”“**”分別表示處理間差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

3 結論與討論

本試驗以果脯制作過程中廢棄的蘋果皮渣為原料，利用蘋果本身含有的天然有益微生物制備蘋果皮渣酵素，通過單因素和正交試驗表明，蘋果皮渣酵素的最佳發酵條件為蘋果渣添加量400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH值5.5、發酵時間150 d，此優化條件下酵素的總酸含量為3.96 g/L，SOD活性為66.2 U/mL。

有研究表明，總酸含量為2～5 g/kg、含糖量較高(可溶性固形物含量≥14.5%或總糖含量≥12.5%)、固酸比偏低(3.0～3.5)時的果實酸甜適宜，風味品質相對較好，優質率最高[15]。本試驗結果表明，施入酵素成熟期的蘋果總酸含量為5.7 g/kg、可溶性固形物含量為14.72%、固酸比為2.58，說明施用蘋果皮渣酵素可以一定程度上提高紅富士蘋果的風味與品質，提高了蘋果的優質率。

將制得的蘋果皮渣酵素施用于有機紅富士蘋果園，考察施入蘋果皮渣酵素對紅富士蘋果果實品質的影響發現，施入酵素的蘋果在生長過程中可溶性固形物含量、總酸含量、硬度均高于未施入酵素的蘋果(對照)，固酸比差別大不；蘋果成熟期時，除果形指數外，單果質量、硬度、可溶性固形物含量、總酸含量、總灰分、維生素C含量、蛋白質含量、還原糖含量、水解后還原糖含量、多酚含量、黃酮含量等指標均高于對照，這可能是因為利用廢棄蘋果皮渣制備而成的酵素，一方面其含有的有機酸可以調節土壤pH值，豐富的有機物可以提高土壤有機質含量，進而提高土壤中各種微量元素的有效含量，另一方面，各種有益微生物及發酵后產生的各種酶能夠迅速催化分解各種有機物，使之在短時間內轉化為可供利用的成分，被果實吸收利用[3，16-18]，進一步促進蘋果中各種營養和功能成分的積累，果實品質得到提升，也使廢棄資源得到有效利用。在今后的研究中，還應對酵素對土壤養分含量的影響及有害病菌的抑制等方面進行深入探索，以更全面地了解酵素在蘋果種植過程中的應用效果。

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