CD44分子的體外巖藻糖基化修飾對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢能力的影響

肖飛，焦競(jìng)，黃玉成，徐海，左偉，王俊文

(武漢市普愛醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖異常活躍，且具有多向分化潛能，在不同誘導(dǎo)環(huán)境下，能向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多類細(xì)胞分化，是組織工程相關(guān)研究被廣泛應(yīng)用的種子細(xì)胞[1]。現(xiàn)已證實(shí)BMSCs可以作為支架載體材料或復(fù)合生物材料應(yīng)用于動(dòng)物骨缺損模型的治療中[2]。然而在臨床應(yīng)用中的效果并不理想，其中最重要的一個(gè)原因便是該細(xì)胞在體內(nèi)定向歸巢能力較差，無法進(jìn)一步發(fā)揮高效的修復(fù)作用。

肖飛，焦競(jìng)，黃玉成，等.CD44分子的體外巖藻糖基化修飾對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢能力的影響[J].實(shí)用骨科雜志，2018，24(2)：143-147.

體外培養(yǎng)的BMSCs注射到受體外周血后，若想定向到達(dá)受損的骨區(qū)域，必須經(jīng)過兩個(gè)階段：第一，必須要克服血管內(nèi)血流的剪切力，滾動(dòng)到靶組織血管內(nèi)皮細(xì)胞表面；第二，BMSCs需要通過一系列黏附分子牢固的結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞表面，進(jìn)而遷移到受損的組織[3]。而在血液中BMSCs的滾動(dòng)和黏附能力取決于BMSCs表面歸巢相關(guān)因子造血細(xì)胞E和L受體(hematopoietic cellE-selectin/L-selectin ligand，HCELL)與廣泛表達(dá)于骨髓微血管內(nèi)表皮的P/E-選擇素相耦合作用[4]。HCELL在其半乳糖端連接有α-2，3-唾液酸基團(tuán)，N-乙酰胺基葡萄糖端連接有α-1，3-巖藻糖基團(tuán)，形成一個(gè)唾液酸化LewisX(sialyl-LewisX，sLeX)的結(jié)構(gòu)，這種sLeX結(jié)構(gòu)正是與E-選擇素耦合的分子基礎(chǔ)[5-6]。而CD44分子的N-乙酰胺基葡聚糖端缺乏α-1，3-巖藻糖基團(tuán)的修飾，于是設(shè)想如果將α-1，3-巖藻糖基團(tuán)連接于CD44分子N-乙酰胺基葡萄糖端，將使BMSCs表面具有足夠多類似HCELL分子結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)BMSCs在血液中的滾動(dòng)和黏附能力，促進(jìn)其定向歸巢作用。

本研究采用兔BMSCs為研究對(duì)象，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的BMSCs，后通過體外巖藻糖基化修飾處理穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs，骨損傷兔體內(nèi)注射BMSCs后，檢測(cè)處理前后BMSCs歸巢能力的變化情況，這將為BMSCs在細(xì)胞治療、基因治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)，且具有重要的理論意義和較大的應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取2個(gè)月齡左右的新西蘭大白兔20只，體重1.5～2.0 kg，在相同條件下分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及材料 含EDFP的慢病毒由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；GDP-巖藻酸購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；α-1，3-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶VI(FTVI)購(gòu)自美國(guó)R&D公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；嘌呤酶素、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購(gòu)自Sigma公司；FITC標(biāo)記的小鼠抗兔CD29抗體、CD34抗體、CD44抗體、CD45抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔血清基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)以及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的ELISA檢測(cè)試劑盒、全蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；小鼠抗兔一抗SDF-1，MCP-1以及山羊抗小鼠IgG二抗均購(gòu)自Abcam公司；小鼠抗EGFP一抗購(gòu)自Millipore公司；SP免疫組化二抗試劑盒-通用型購(gòu)自Invitrogen公司；其他常用化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 兔BMSCs的原代分離、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定 取新西蘭大白兔一只，以3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，從兔股骨粗隆處使用16號(hào)骨穿針穿刺，12號(hào)腰穿針鉆入骨髓腔后，使用15 mL含肝素鈉的生理鹽水(1 200 U/mL)自12號(hào)針注入，從16號(hào)針處接取沖出物，將沖出物與1×PBS按1︰1混勻稀釋，等比例加入含percoll的分離液，2 000 r/mim離心15 min，吸取含單個(gè)核細(xì)胞的乳白色界面層置于另一個(gè)離心管中，1×PBS洗滌1次后，用5 mL DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素)重懸并轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后進(jìn)行首次換液，以后間隔3 d換液。待原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)消化傳代，按1︰3的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記作P1；傳代培養(yǎng)過程中隔日更換培養(yǎng)基，直至貼壁細(xì)胞彼此融合至80%時(shí)，再重復(fù)以上操作進(jìn)行下一代傳代接種培養(yǎng)，并記為P2，依次類推，傳至P3，為實(shí)驗(yàn)備用。原代培養(yǎng)過程中每日采用倒置顯微鏡對(duì)兔BMSCs進(jìn)行拍照，觀察其生長(zhǎng)狀況并做相關(guān)記錄。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)兔BMSCs表面標(biāo)志物 生長(zhǎng)狀態(tài)較好的P3代細(xì)胞，棄培養(yǎng)基使用0.2%的胰酶消化1 min，收集于15 mL離心管中，1 200 r/mim離心5 min，使用1×PBS洗滌細(xì)胞1次后，細(xì)胞計(jì)數(shù)分管，各管中加入單克隆抗體CD29、CD34、CD44、CD45，同時(shí)每管設(shè)置陰性對(duì)照組，避光孵育40 min。使用1×PBS洗滌細(xì)胞2次后，500 μL1×PBS重懸，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs的篩選 取生長(zhǎng)良好的P3代BMSCs以1.0×105個(gè)/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到約80%匯合時(shí)，加入3 mL DMEM培養(yǎng)基和1 mL的含EDFP的慢病毒液(滴度：1.25×108TU/mL)，置入5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間使用含0.5 μg/mL的嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞篩選培養(yǎng)。首次培養(yǎng)24 h后，每日在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)以及EGFP的表達(dá)情況觀察。

1.6 兔BMSCs的體外巖藻糖基化處理 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs，使用HBSS清洗2次，加入提前配置好的α-1，3-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶Ⅵ反應(yīng)體系(將60 mU/mL α-1，3-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶Ⅵ溶于5 mL含有20 mM HEPES、1%HAS及1mMGDP-巖藻酸的HBSS)，37℃孵育40 min。4℃，1 200 r/mim離心5 min，棄上清，使用HBSS清洗一次，重懸細(xì)胞于2% PBS至濃度約為5.0×106個(gè)/mL備用。

1.7 兔脛骨骨折模型構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)分組 選取新西蘭大白兔15只，適應(yīng)性暫養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。依次開通耳緣靜脈，注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)，麻醉起效后將兔仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，左后肢脫毛、碘伏消毒、鋪巾。取小腿前內(nèi)側(cè)切口4～5 cm，鈍性分離脛前肌，暴露兔脛骨，以擺鋸于脛骨中段人為造成橫形骨折，后用7孔微型解剖鋼板1枚，螺絲釘6枚固定骨折端，骨折線上下各3枚螺絲釘。以生理鹽水沖洗后分層關(guān)閉切口。術(shù)后將兔隨機(jī)分成三組：對(duì)照組(Control)5只，每只尾靜脈注射2 mL生理鹽水作為對(duì)照；BMSCs治療組(BMSCs)5只，每只尾靜脈注射2 mL未經(jīng)巖藻糖基化處理的BMSCs(5.0×106個(gè)/mL)；巖藻糖基化處理的BMSCs治療組(BMSCs+Fuc)5只，每只尾靜脈注射2 mL經(jīng)巖藻糖基化處理的BMSCs(5.0×106個(gè)/mL)。兔麻醉蘇醒后按分組放入籠內(nèi)同條件繼續(xù)飼養(yǎng)，所有兔均予20萬U的青霉素一次肌肉注射，持續(xù)3d。術(shù)后6周處死各組兔，取樣進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.8 ELISA進(jìn)行兔血清中SDF-1、MCP-1水平檢測(cè) 術(shù)后6周處死各組兔，采取3組兔血液樣本，血液樣本采集后在室溫下放置20 min，離心，吸取上清液，-20℃保存待測(cè)，待所有血清樣本收集完后，分別采用兔血清SDF-1和MCP-1的ELISA檢測(cè)試劑盒，按照說明書操作方法進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度值，計(jì)算三組血清樣本中SDF-1、MCP-1水平。

1.9 損傷骨組織SDF-1、MCP-1的Western Blot檢測(cè) 術(shù)后6周處死各組兔，取手術(shù)損傷處骨組織提取總蛋白、BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。操作步驟如下：取20 μg蛋白和4 μL 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；PBS洗膜；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜后加入對(duì)應(yīng)一抗(SDF-1，1︰2 000；MCP-1，1︰2 000)4℃，孵育過夜；PBS洗膜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗小鼠IgG(1︰5 000)孵育0.5 h；PBS洗膜；用DAB化學(xué)放光進(jìn)行顯色。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，后采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.10 免疫組化檢測(cè)損傷骨組織EGFP的表達(dá) 術(shù)后6周處死各組兔，取手術(shù)損傷處骨組織。固定后，EDTA脫鈣、脫水、石蠟包埋，制作切片；將制作好的切片置于pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗，滴加小鼠抗EGFP一抗(1︰1 000)，4℃孵育過夜；按照免疫組織化學(xué)試劑盒中指示滴加二抗，孵育30 min；PBS沖洗3次，DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果，以出現(xiàn)棕黃色染色判定為陽(yáng)性結(jié)果。后采用IPP 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算EGFP陽(yáng)性染色百分比，后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)鑒定 倒置顯微鏡下觀察(見圖1)，原代培養(yǎng)48 h換液，可見部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或多邊形狀(見圖1a)；培養(yǎng)至3 d時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，集落逐漸增大，呈漩渦狀；培養(yǎng)至9 d時(shí)，細(xì)胞逐漸融合成片，形成單層細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛；傳代培養(yǎng)至P3代時(shí)，BMSCs在形態(tài)學(xué)上更加趨于一致，為排列更加有序的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，純度達(dá)90%以上(見圖1b)。

a 原代分離48 h b 傳代培養(yǎng)3 d

圖1 不同時(shí)期BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察(×200)

2.2 BMSCs的流式鑒定 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離培養(yǎng)的兔BMSCs表面標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果顯示見圖2，CD29，CD44成陽(yáng)性(見圖2a，2c)，陽(yáng)性率分別為97.81%，95.24%；CD34和CD45均成陰性(見圖2b，2d)，陽(yáng)性率僅為1.85%和2.89%，符合BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)特征。

2.3 穩(wěn)定表達(dá)EGFP的BMSCs的篩選 熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果顯示見圖3，培養(yǎng)48 h后即可在轉(zhuǎn)染了帶EGFP慢病毒的BMSCs中看見明亮的EGFP表達(dá)(見圖3a)，繼續(xù)篩選到3周后，可在BMSCs中看見大量明亮的EGFP表達(dá)(見圖3b)，說明篩選培養(yǎng)得到了持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。

2.4 血清中SDF-1、MCP-1水平檢測(cè)(ELISA) 手術(shù)6周后處死各組兔，采集血液，收集上清，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示見圖4，與對(duì)照組相比，普通BMSCs治療組SDF-1、MCP-1的分泌水平均顯著上升(見圖4a，P<0.05)；與普通BMSCs治療組相比，經(jīng)體外巖藻糖基化處理的BMSCs治療組SDF-1、MCP-1的分泌水平均極顯著上升(見圖4b，P<0.01)。

2.5 Western Blot檢測(cè)SDF-1、MCP-1蛋白表達(dá)水平 手術(shù)6周后處死各組兔，取損傷處骨組織，提取全蛋白，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示見圖5a，與對(duì)照組相比，普通BMSCs治療組SDF-1、MCP-1蛋白的表達(dá)水平均顯著上升見圖5b～5c，P<0.05)；與普通BMSCs治療組相比，經(jīng)體外巖藻糖基化處理的BMSCs治療組SDF-1、MCP-1蛋白的表達(dá)水平均極顯著上升(見圖5b～5c；P<0.01)。

2.6 免疫組化檢測(cè)損傷骨組織EGFP的表達(dá) 手術(shù)6周后處死各組兔，取損傷處骨組織，制作切片，EGFP免疫組化染色結(jié)果顯示(見圖6)，相對(duì)于未經(jīng)巖藻糖基化處理的BMSCs治療組而言，經(jīng)巖藻糖基化處理過的BMSCs治療組兔損傷骨組織處的EGFP陽(yáng)性面積比值較多，且二者差異顯著(P<0.05)，說明BMSCs經(jīng)巖藻糖基化處理后，到達(dá)損傷骨組織處的BMSCs明顯增多，歸巢能力明顯增強(qiáng)。

3 討 論

目前研究表明，臨床骨損傷修復(fù)的主要難題為體內(nèi)成骨緩慢。BMSCs作為一種具有多向分化能力的干細(xì)胞，在骨損傷修復(fù)方面具備極大的發(fā)展前景[7]。干細(xì)胞定向到達(dá)損傷部位跟其歸巢能力密切相關(guān)，干細(xì)胞歸巢是指自體的或外源性的干細(xì)胞在多種因素的作用下穿過內(nèi)皮細(xì)胞定向遷移至靶向組織血管并定植的過程[8-9]。這一過程中，BMSCs需跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)并在多種趨化因子、生長(zhǎng)因子及黏附分子作用下實(shí)現(xiàn)歸巢和植入，從而進(jìn)一步發(fā)揮修復(fù)作用[8]。

盡管目前對(duì)BMSCs向炎癥或損傷組織歸巢的具體機(jī)制尚不清楚。但已有研究表明，這可能與炎癥或損傷組織表達(dá)能夠誘發(fā)并導(dǎo)致與遷移、黏附及穿出相關(guān)的特異性受體和配體的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)[10]。對(duì)于如何有效地增強(qiáng)BMSCs向靶向組織歸巢的能力，主要有以下幾種途徑：a)合適的培養(yǎng)環(huán)境：為了獲取足夠數(shù)量的BMSCs，往往需要在體外對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。這就不可避免的導(dǎo)致BMSCs在培養(yǎng)過程中發(fā)生老化或氧化損傷，從而影響細(xì)胞的增殖、多向分化和歸巢潛能。Bolno等[11]人研究發(fā)現(xiàn)，粒細(xì)胞集落刺激因子可通過影響其表面CD44與其受體的結(jié)合能力從而來提高BMSCs的歸巢能力；b)轉(zhuǎn)染有利于歸巢的基因至BMSCs：主要是將一些能夠影響B(tài)MSCs歸巢能力和活性的趨化因子、黏附分子等基因分子轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)至BMSCs，從而增強(qiáng)它們的表達(dá)并發(fā)揮相應(yīng)作用。例如，Zhou等[12]人證明轉(zhuǎn)染了SDF-1基因的BMSCs能明顯強(qiáng)化BMSCs的動(dòng)員、遷徙、穿出和定植能力。劉舉等[13]人的研究表明MCP-1的體外誘導(dǎo)能顯著提升小鼠BMSCs的靜脈移植效率；c)提高BMSCs對(duì)血管內(nèi)皮的黏附能力；回輸?shù)腂MSCs黏附于血管內(nèi)皮上是其歸巢至靶向組織行使修復(fù)功能的前提。Sarkar等[14]人通過生物素-鏈霉親和素化學(xué)結(jié)合法將包含sLeX結(jié)構(gòu)的納米級(jí)聚合物結(jié)合至BMSCs表面，從而使其具有與E選擇素和P選擇素緊密結(jié)合的能力。并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明高表達(dá)sLeX的BMSCs對(duì)于炎性組織歸巢能力顯著強(qiáng)于對(duì)照組。Sackstein[15]則通過研究證明了糖基化工程酶化處理BMSCs表面CD44分子，將其轉(zhuǎn)化為具有向骨歸巢能力的HCELL分子，從而提高其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面E選擇素的結(jié)合能力，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了巖藻糖基化處理后的BMSCs向骨髓歸巢的能力顯著增強(qiáng)，且仍保持其多向分化能力。說明通過體外特定方式處理BMSCs，提高其對(duì)血管內(nèi)皮的黏附能力，能夠有效促進(jìn)BMSCs回輸體內(nèi)后的靶向歸巢能力。

a CD29表達(dá)的流式檢測(cè) b CD34表達(dá)的流式檢測(cè) c CD44表達(dá)的流式檢測(cè) b CD45表達(dá)的流式檢測(cè)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)記物

a 轉(zhuǎn)染EGFP慢病毒48h b 轉(zhuǎn)染EGFP慢病毒3周 a SDF-1 b MCP-1

圖3 穩(wěn)定表達(dá)EGFP的BMSCs的篩選 圖4 血清中SDF-1和MCP-1的ELISA檢測(cè)

a 免疫印跡結(jié)果 b SDF-1 c MCP-1

圖5 損傷骨組織中SDF-1和MCP-1蛋白水平的Western Blot檢測(cè)

a BMSCs b BMSCs+Fuc c EGFP免疫組化陽(yáng)性率比較

圖6 不同BMSCs治療情況下?lián)p傷骨組織EGFP的表達(dá)

本研究采用EGFP作為標(biāo)記物探究經(jīng)巖藻糖基化處理的BMSCs在缺損部位的歸巢情況。結(jié)果顯示，骨損傷兔血清及損傷骨組織處的SDF-1和MCP-1均有顯著增加，且到達(dá)損傷骨組織處的BMSCs明顯增多。證明經(jīng)巖藻糖基化處理的BMSCs的歸巢能力得到顯著提升，這一過程可能與SDF-1和MCP-1的相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)，這將為臨床上干細(xì)胞的骨損傷修復(fù)研究奠定可靠的理論基礎(chǔ)。

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