巨菌草一株內生固氮菌的分子鑒定及生物學特性

葉文雨 謝序澤 楊林青 邱學鴻牛曉慶 胡紅莉 余文英 魯國東

摘要 菌草（JUNCAO）是可作為栽培食用菌、藥用菌的草本植物。內生固氮菌具有生物固氮的功能，可以促進植物生長，提高植物對病原菌的拮抗作用。采用無氮培養基、乙炔還原法等方法從巨菌草根中分離純化到1株具有較強固氮酶活性的菌株，固氮酶活性值為270.20 nmolC₂H₄/（mL·h）。通過16S rDNA序列分析，進一步確定該菌株屬于變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。內生固氮菌株fjg102對稻瘟病菌Guy11和Ku70的抑菌率分別為40.25%和44.30%，具有一定的抑制病原菌的作用。菌株fjg102革蘭氏染色陽性，具有溶磷作用、觸酶反應為陽性、明膠液化為陽性等生理生化特性。盆栽試驗結果表明，接種fjg102菌株后對大麥有明顯的促生作用。其中葉長增加37.26%，根長增長9.40%，根重增加66.16%，鮮重增加96.40%，干重增加80%。可見，該內生固氮菌株具有生物固氮和促生的效果，可進一步研究開發成為微生物肥料生產菌種。

植物的生長需要各種營養元素，氮是生長發育必須的大量營養元素之一。空氣中的氮必須通過固氮微生物的轉化植物才能利用[1-2]。植物內生固氮菌（Endophytic diazotroph）是指那些定殖在健康植物體內，與宿主植物進行聯合固氮的一類微生物[3-4]。發掘植物內生固氮菌資源遺傳多樣性已成為非豆科作物高效利用生物固氮戰略的主攻方向之一。內生固氮菌可以促進植物生長、抑制植物病害、提高植物產量、降低化肥使用量，減少水土污染、保持農業可持續發展、改善生態環境[15]。內生固氮菌有利于營養供應和微環境適宜的生態位，避免了化合態氮的抑制及土著微生物的競爭，進而促進作物的生長及產量的提高[6-7]。野生稻內生菌根瘤菌（Rhizo-bium）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）等對水稻紋枯病有一定的抑制作用[8]，芽孢桿菌（Bacillus）對赤霉病等病害可產生良好的防治效果[9]。高玲玲等[10]研究發現，多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對水稻白葉枯病、條斑病、稻瘟病、紋枯病和惡苗病等5種主要病原菌都有抑制作用。

菌草（JUNCAO）是可作為栽培食用菌、藥用菌的草本植物。巨菌草屬于禾本科植物狼尾草屬，具有營養豐富、植株高大、單位面積產量高、適應性強、資源豐富、易于人工栽培、資源可持續利用等生物學特性，有較高的研究、開發和利用價值[11]。目前為止，已從甘蔗、水稻、小麥、玉米、白菜、芹菜等植物中分離到內生固氮菌[12]，但對巨菌草內生固氮菌的研究較少。為了探明巨菌草體內是否存在高效的固氮菌及其固氮機理，本研究通過純培養手段和分子生物學手段對福州巨菌草內生固氮菌進行了分離及生物學特性研究，以期揭示內生固氮菌的特征，為豐富固氮微生物菌種資源庫和開發利用巨菌草內生固氮菌提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年3月，采于福建農林大學后山貧瘠山坡荒地，采集生長良好的巨菌草植株，立即用白封袋密封，帶回實驗室放入4℃冰箱中保存備用。

1.2 培養基

Dobereiner改良無氮培養基（簡稱DN） [13]： Sucrose 10 g/L; Malicacid5g/L; K₂HPO₄·H₂O₂ 0.2g/L;NaCl 0.1g/L; KH₂PO₄·H₂O₂ 0.4 g/L; FeCl₃ 0.01g/L;Na₂MoO₄ 0.002 g/L; MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L（單獨滅菌）;CaCl₂·H₂O 0.02 g/L（單獨滅菌）;Agar 1.5%/L（固體）;Agar 0.2%/L（半固體）;pH調至7.0;NFb培養基[14];malic acid 5.0 g/L， K₂HPO₄ 0.5 g/L; MgSO₄·7H₂O0.2 g/L; NaCl 0.1 g/L; CaCl₂ 0.02 g/L; bromthymolblue 0.5% （in KOH 0.2 mol/L）2.0 mL/L;

vitaminsolution 1mL/L; micronutrient solution 2mL/L;1.64% Fe-EDTA solution 4mL/L; KOH4.5 g/L; pH調至6.8。其中vitamin solution. biotin 100 mg/L;pyridoxol-HCl：200 mg/L; micronutrient solution： CuSO₄ 0.4g/L; ZnSO₄·7H₂O 0.12 g/L; H₂BO₃1.4g/L; Na₂MoO₄·2H₂O 1.0g/L; MnSO₄ 1.5 g/L（固體培養基中加入Agar 15 g/L.半固體培養基中加入Agar 2-4 g/L）;加碘反應和觸酶反應用LB固體培養基（LB液體培養基加瓊脂15g/L）;內生細菌的運動作用用LB半固體培養基（胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，瓊脂5g/L）：無機磷溶解PKO培養基（FeSO₄0.003 g/L，葡萄糖10g/L， Ca₃（PO₄）₂ 5.0 g/L，

（NH₄）₂SO₄0.5 g/L， MnSO₄0. 03 g/L，0.03g MgSO₄·7H₂O/L， NaCl 0.2 g/L， KCl 0.2 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂20 g /L， pH值6.8-7.0。其中Ca₃（PO₄）₂。過篩并單獨滅菌后與培養基混合）;淀粉水解用培養基（可溶性淀粉2g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，瓊脂15g/L，配好后調PH至7.0）;明膠液化培養基（牛肉膏蛋白胨液體培養基1000mL/L，明膠12g/L，在水浴鍋中熔化混勻，調PH至7.2～7.4，121℃高壓滅菌，30 min）：病原菌拮抗試驗用PDA固體培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂40.1 g/L）。

1.3 菌株的分離、純化

菌株的分離、純化[14];將采集的新巨菌草植物樣本先用自來水沖洗，然后用剪刀剪下根并分別置于已滅菌的2個培養皿中，接著用70%的乙醇（C₂H₂OH）處理5 min（除去根表面的腐爛物質），無菌水洗滌多次，再用2%的次氯酸鈉（NaCIO）消毒2～3min，無菌水洗滌5～7次.每次5～10 min。最后將表面消毒完全的根用手術刀切碎，分別接種到3支裝有NFb半固體培養基的試管中，密封后，置于溫度為28℃，濕度為85%的人工培養箱內進行培養。待24 h后，向管內注入1%體積的乙炔氣體，在同樣條件的人工培養箱內培養24 h，測定其固氮酶活性。將具有固氮活性的混合菌株接至固體NFb培養基上進行培養。再挑取單菌落分別涂板直到得到純的菌株為止。

1.4 內生茵形態、培養特征

取培養48 h的菌株進行革蘭氏染色，觀察內生菌的形態特征。

1.5 氣相色譜法測定固氮酶活性

固氮酶活性測定采用乙炔還原法[15]。將已純化的菌株再次接入盛有NFb半固體培養基的試管內，密封后，置于溫度為28℃，濕度為85%的人工培養箱內進行培養。待24h后，向10mL試管內注入1%體積的乙炔氣體，在同樣條件的人工培養箱內培養24h，用SP-2100氣相色譜儀（北京分析儀器廠）測定其固氮酶活性。用下列公式計算固氮酶活性大小：N= （hx×C×V）/（hs×24.9×t），式中，hx為樣品峰值（峰面積）;hs為標準C₂H₄峰值（峰面積）;C為標準C₂H₄的濃度（nmol/mL）;V為培養容器體積（mL）;t為樣品的培養時間，即C₂H₄的反應時間（h）;N為產生的C₂H₄濃度（nmol/mL·h）。挑取固氮酶活性較高的樣品，用20%甘油于-20℃保存備用。

1.6 16S rDNA基因擴增

試劑盒抽提法提取內生菌DNA。16S rDNA基因序列PCR擴增引物為細菌通用引物，27F（5'AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA擴增。PCR反應體系總體積為25μL，Taq Mix DNA聚合酶12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，去離子水10.5μL。PCR反應程序為94℃預變性5min; 94℃變性30s，56℃退火90s，72℃延伸2min， 30個循環;72℃延伸10min，4℃保存。反應完成后用1%的瓊脂糖電泳檢測PCR產物。擴增產物送華大基因生物技術有限公司測序。測序結果在GenBank （http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進行BLAST，選取與目標菌株相似性較近的菌株序列，使用ClustalX軟件進行同源性比對;利用MEGA 5.2軟件采用鄰近法（neighbor-joiningmethod）聚類分析并構建系統發育樹，設定Bootstrap為1000，初步確定菌株的分類地位。

1.7 生物學特性

運動性試驗、觸酶試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、溶磷能力等試驗參照《微生物學實驗》[16]進行。

1.8 促生實驗

將活化得到的單菌落采用LB液體培養基于28℃培養48h，培養得到的培養液（OD₆₀₀=0.6）.大麥生長3～4 d后，每盆澆灌菌液15 mL，同時澆灌同樣祥體積的清水作為對照，15d后測量大麥的葉長、根長、鮮重、干重等，計算菌株對大麥的促生作用。

2 結果與分析

2.1 菌株形態、培養特征

在固體LB培養基上28℃培養24h后，菌株fjg102形成乳白色不透明菌落，菌落近似圓形，邊緣整齊，中間有小突起，不分泌色素（圖1-A）;fjg102菌體細胞為短桿狀，革蘭氏阻性（圖1-B）。

2.2 分離純化及固氮酶活性的測定

采用培養基培養法從巨菌草（圖1-C）根中分離純化得到一株內生固氮菌菌株fjg102。對該菌株用乙炔還原法進行固氮酶活性測定，其固氮酶活性值為270.20 nmol/mL·h，表明該菌株具有較強的固氮酶活性。

2.3 16S rDNA序列分析及系統發育

擴增菌株16S rDNA約1500 bp長度的擴增產物，擴增產物交華大基因有限公司進行測序。將獲得的序列輸入到Genbank數據庫中進行BLAST比對。將相似性比較相近的模式菌株序列用MEGA5.2軟件，采用鄰接法構建系統發育樹（圖2-A）。結果表明，菌株fjg102與變棲克雷伯氏菌（Kleb-siella variicola）親緣關系較近.其序列相似性均為99%）。結合其形態及其生理生化特征將fjg102可歸為變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。

2.4 菌株的生理生化特性

2.4.1 觸酶試驗

觸酶可以催化將過氧化氫分解成為水和氧的反應，觸酶的功能是將代謝過程產生的、具有毒性的過氧化氫除去，以保護細菌不被傷害。菌株fjg102觸酶反應均為陽性（圖4），說明它們具有排除代謝中產生的過氧化氫的能力。

2.4.2 溶磷圈的產生

采用溶磷圈法菌株的溶磷性，巨菌草內生菌fjg112菌株的周圍有溶磷圈出現，溶磷能力檢測的結果表明，該菌株具有溶磷能力，溶磷能力D/d（透明圈得直徑與菌落的直徑的比值）為1.07，具有一定的溶磷能力（圖4）。

2.4.3 運動性試驗

采用半固體培養基穿刺接種法，培養后觀察接種線及其周圍的生長狀況，有動力的細菌可在接種線周圍生長，造成模糊。無動力的則接種線清晰可見，周圍無生長。巨菌草內生菌fjg102菌株的運動性檢測的結果表明，該菌株接種線清晰可見，說明該菌株不具有運動性能（圖5-A）。

2.4.4 明膠液化試驗

某些細菌可產生一種胞外酶明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養基成為流動的液體。試驗結果表明，菌株fjg102具有膠原酶，使明膠被分解，失去凝固能力，呈現液體狀態，具有明膠液化現象（圖5-B）。

2.4.5 拮抗真菌實驗

采用平板對峙法檢測菌株fjg102對病原真菌的抑制效果，結果表明fjg102菌株對稻瘟病菌Guy11和Ku70的抑菌率分別為40.25%和44. 30%，對病原真菌具有一定的拮抗作用。

2.4.6 內生固氮菌對大麥的促生作用

將活化得到的單菌落采用LB液體培養基于28℃培養48h，培養得到的培養液（OD₆₀₀=0.6）每盆澆灌15mL于生長一周左右的大麥根部。15d后與未接種的對照相比，對大麥有明顯的促生作用（圖6）。其中葉長增加37.26%，根長增長9.40%.根重增加66.16%，鮮重增加96.40%，干重增加80%（表1）。

2.4.7 菌株對大麥的致病性分析

將活化得到的單菌落采用LB液體培養基于28℃培養48h，培養得到的培養液（OD₆₀₀=0.6），接培養菌液于生長一周左右的大麥的葉片進行離體接菌，每處理重復3次，5～7d后調查葉片發病情況并拍照。結果表明菌株fjg102對大麥葉片沒有致病性（圖7）。

3 結論與討論

內生固氮菌定殖于植物內部，在植物細胞內、細胞間隙、木質部導管等進行固氮及其它促生作用。內生固氮菌不僅能為宿主植物提供氮營養元素，而且還能促進植物生長，增強植物的抗逆性，是一類具有巨大應用潛力的微生物資源。自內生菌研究以來，許多學者在不同的植物中分離到了不同種的內生固氮菌。如胡文哲等[17]從廣西野生稻分離到了5個內生固氮菌類群;劉天增等從狗牙根中分離到內生固氮菌等。已有學者從水稻、甘蔗等植物中分離到了變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。已有研究表明，固氮菌能在甘蔗根和地上部分組織內生存和定殖，可以有效促進甘蔗植株生長和對礦質營養的吸收[18-20]。劉璇等[21]分離的固氮菌具有解鉀能力。龔鳳娟等[22]分離的固氮菌具有較高的ACC脫氨酶活性。葛安輝發現與變棲克雷伯氏菌（Kleb-siella variicola）的相似性高達99%聯合固氮菌株，羧甲基纖維素和甘油的添加能顯著提高該菌株的固氮酶活性[23]。本研究以福建巨菌草的根為材料，采用不同的選擇性培養基進行分離和純化，分離得到一株內生固氮菌，經16S rDNA系統發育分析，初步鑒定為變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola），表明該內生固氮菌具有較高的固氮酶活性。該菌株還具有溶磷性、觸酶反應為陽性、明膠液化為阻性等生物學特性。因此，本研究分離得到的變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）菌株在菌肥方面具有非常好的應用前景。

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