海南五指山茶園土壤中耐鋁細(xì)菌的分離鑒定及其耐鋁特性

李怡 彭文濤 李勤奮 鄧曉 吳東明 武春媛

摘要 從海南五指山茶同土壤中分離得到2株高效耐鋁細(xì)菌，命名為A3、A4。根據(jù)表型、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性分析，將其分別鑒定為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）、短波單胞菌屬（Brevundimonassp.）。A3可耐受12 mmol/L Al³⁺，菌株A4最高可耐受20 mmol/L Al³⁺。選取耐鋁效果較好的菌株A4，進(jìn)一步研究其在不同濃度Al³⁺（0、10、20 mmol/L）下的生長(zhǎng)規(guī)律。發(fā)現(xiàn)菌株A4在Al³⁺存在條件下，pH為4.5-5.0時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基起始pH的變化并不敏感;菌株A4的耐鋁能力并不受Al³⁺誘導(dǎo)而變化，足其本身的同有特性。試驗(yàn)結(jié)果可為耐鋁細(xì)菌改良酸性土壤提供良好的菌種資源。

關(guān)鍵詞 Al³⁺;耐鋁細(xì)菌;耐鋁能力;耐鋁特性

海南島土壤面積為33920 km²，以富鋁化為主要過(guò)程的鐵鋁土占全省土壤總面積的80.1%：全省土壤平均pH為5.20[1]。鐵鋁土中活性鋁的含量較高，導(dǎo)致其所占土壤陽(yáng)離子交換總量比例增加，直接影響土壤的酸化程度;高濃度活性鋁毒害作物根系，致使植物減少土壤養(yǎng)分吸收[2]。近年來(lái)，隨著作物連作現(xiàn)象的日益嚴(yán)重，土壤中活性鋁的濃度不斷升高[3]。

在pH<5的溶液中，活性鋁主要以Al³⁺存在，除對(duì)植物產(chǎn)生嚴(yán)重毒害[4]外，還可導(dǎo)致土壤釋放出重金屬等污染物，污染地表水和地下水，危害水生生物生殖與發(fā)育、對(duì)人的骨骼、生殖系統(tǒng)、造血系統(tǒng)造成嚴(yán)重毒性[5]。

活性鋁影響微生物的生長(zhǎng)代謝，嚴(yán)重時(shí)引起細(xì)胞凋亡，同樣對(duì)微生物產(chǎn)生嚴(yán)重毒害[6]。土壤微生物對(duì)土壤質(zhì)量、肥力的形成和演化起著重要的作用，因此，高濃度活性鋁脅迫微生物，是導(dǎo)致土壤日益酸化的重要原因。

微生物，尤其是細(xì)菌對(duì)環(huán)境變化比較敏感，相比動(dòng)植物生長(zhǎng)周期較短[7]，經(jīng)高濃度活性鋁篩選而存活的耐鋁微生物，是改良酸性土壤的理想資源;細(xì)菌還具有遺傳操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，生物耐鋁的完整分子機(jī)制最可能首先通過(guò)細(xì)菌與鋁相互作用方面獲得突破;耐鋁微生物，尤其是耐鋁細(xì)菌，是闡明生物耐鋁機(jī)制的理想研究材料。

國(guó)內(nèi)外已陸續(xù)分離到一些耐鋁微生物，已報(bào)道的能耐鋁的細(xì)菌有Acidocella aluminiidurans， Flavobac-terium sp.，Pseudomonas fluorescens， Arthrobactersp.，Burkholderia sp.， Burkholderia sp. SB1，Bacillus cereus B5[5-6，8-13]等，真菌有Saccharomycescerevisiae， Lipomyces， Rhodotorula taiwanensisRS1[12，14-15]等.目前獲得的真菌主要為酵母類(lèi)，耐鋁細(xì)菌數(shù)量與種類(lèi)較少，主要為熒光假單胞菌（Pseu-domonas fluorescens）及伯克霍爾德菌（Burhholderiasp.），這是因?yàn)樵谒嵝酝寥乐校婢ǔ１燃?xì)菌更耐鋁，耐鋁細(xì)菌分離較難[16]。因此，細(xì)菌的耐鋁機(jī)制研究進(jìn)展較為緩慢。本文試圖從五指山茶園酸性土壤中分離篩選多株不同種屬的高效耐鋁細(xì)菌，并研究其耐鋁能力及耐鋁特性，為耐鋁細(xì)菌在酸性土壤中的應(yīng)用提供資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品取白海南五指山茶園土壤，采集地表5～15cm土壤，pH為4.97。Escherichia coli DH 5α，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 耐鋁細(xì)菌的分離篩選

配制S-LB培養(yǎng)基[17]。將1g土樣加入9 mL pH5.0，Al³⁺濃度為20 mmol/L的S-LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩5d，將富集液稀釋涂布，將生長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行純化。

1.2.2 耐鋁菌株的鑒定

菌株形態(tài)、生理生化特征測(cè)定參照文獻(xiàn)[18-19]進(jìn)行。菌株基因組DNA提取參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。采用通用引物27F、1492R擴(kuò)增16S rRNA基因序列[21]。

PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×Buffer 2.5μL，Mg²⁺ （25 mmol/L） 2.0μL， dNTP （10 mmol/L） 2.5μL，27F、1492R引物（25μmol/L）各0.5μL，菌株基因組DNA 0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，滅菌超純水至25μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃2 min; 94℃0.5 min，55℃0.5min， 72℃1.5min，循環(huán)30次;72℃10 min，10℃10min。PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收，TA克隆后進(jìn)行測(cè)序（由華大基兇完成）。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在http：//eztaxon-e.e zbiocloud.net/下載同源性較高的16S rRNA基因序列[22]，用MEGA version 5.0軟件構(gòu)建耐鋁菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[23]。

1.2.3 菌株耐鋁能力初步分析

將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，無(wú)菌水洗菌調(diào)至OD₆₀₀=0.5，取3μL菌液分別點(diǎn)接于pH 5.0，不同Al³⁺濃度（0、10、12、15、20、25 mmol/L）的S-LB固體培養(yǎng)基，以不耐鋁的E.coli DH5α作為對(duì)照，30℃培養(yǎng)3d，重復(fù)3次，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.2.4 不同濃度Al³⁺對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

選取耐鋁效果較好的菌株，無(wú)菌水洗菌調(diào)至OD₆₀₀=0.5，2%接種量加于pH 5.0.不同Al³⁺濃度（0、10、20 mmol/L）的S-LB培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min培養(yǎng)3d，定時(shí)取樣測(cè)定OD₆₀₀，3次重復(fù)。

1.2.5 pH對(duì)菌株在Al³⁺中生長(zhǎng)的影響

設(shè)置含15mmol/L Al³⁺的S-LB培養(yǎng)基pH分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0，選取耐鋁效果較好的菌株，無(wú)菌水洗菌調(diào)至OD₆₀₀=0.5，2%接種量加于上述培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3d，重復(fù)3次，測(cè)定菌株OD₆₀₀。

1.2.6 Al³⁺對(duì)菌株耐鋁性的誘導(dǎo)

選取耐鋁效果較好的菌株，分別在含0和15mmol/L Al³⁺的液體S-LB中培養(yǎng)3d，并分別接入同種濃度Al³⁺的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接5次后，無(wú)菌水洗菌調(diào)至OD₆₀₀=0.5，分別以2%接種量加于0和15 mmol/LAl³⁺的液體S-LB中培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定菌株OD₆₀₀。不加Al³⁺培養(yǎng)的原始菌液，接種到0和15 mmol/LAl³⁺的S-LB中，分別定義為處理1和處理2;加入15mmol/L Al³⁺培養(yǎng)的原始菌液，接種到0和15mmol/L Al³⁺的S-LB中，分別定義為處理3和處理4。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鋁細(xì)菌的分離及生理生化特征測(cè)定

從海南茶園土壤中分離純化得到2株高效耐鋁細(xì)菌，命名為A3、A4。對(duì)這2株菌進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化特征測(cè)定，菌落圖片見(jiàn)圖1，生理生化特征測(cè)定結(jié)果如表1。

由表1可看出，分離到的2株耐鋁細(xì)菌菌株均為革蘭氏陰性菌，且2株菌具有不同的菌落形態(tài)和生理生化特性，這說(shuō)明2株菌的分類(lèi)地位顯著不同。

2.2 菌株16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育地位的確定

對(duì)2株耐鋁細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序，同源性比對(duì)后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明.菌株A3的16S rRNA基因與Acine-tobacter bereziniae具有較高的序列相似性，相似度為99.79%。菌株A4的16S rRNA基因與Brevundi-monas vesicularis具有較高的序列相似性，相似度為99.7%。同時(shí)系統(tǒng)發(fā)育分析也表明，A3、A4在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上分別與Acinetobacter guillouiae、Bre-vundimonas nasdae聚類(lèi)在一個(gè)亞分支上。結(jié)合其生理生化特性及16S rRNA序列分析結(jié)果，將菌株A3、A4分別鑒定為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）和短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.）。

2.3 菌株耐鋁能力初步分析

對(duì)菌株A3、A4的耐鋁能力進(jìn)行初步分析。結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)果表明，在10mmol/L Al³⁺的培養(yǎng)基中，不耐鋁的對(duì)照菌已無(wú)法生長(zhǎng)，但菌株A3、 A4生長(zhǎng)良好;在含有12 mmol/L Al³⁺的培養(yǎng)基中，菌株A3、A4均生長(zhǎng)良好，且菌株A4生長(zhǎng)情況較好：在含有15 mmol/LAl³⁺的培養(yǎng)基中，菌株A3已無(wú)法生長(zhǎng)：在含有20 mmol/L Al³⁺的培養(yǎng)基中，菌株A4仍能生長(zhǎng);在含有25 mmol/L Al³⁺的培養(yǎng)基中，菌株A4停止生長(zhǎng)。這說(shuō)明，菌株A4的耐鋁能力較強(qiáng)，可耐受20 mmol/L Al³⁺;菌株A3可耐受12 mmol/L Al³⁺。

2.4 不同濃度Al³⁺對(duì)菌株A4生長(zhǎng)的影響

選取耐鋁效果較好的菌株A4作為研究對(duì)象，測(cè)定其在不同濃度Al³⁺（0、10、20 mmol/L）下的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖3。

結(jié)果表明，Al³⁺濃度為10 mmol/L時(shí)，菌株A4的生長(zhǎng)并未受到抑制，與不加Al³⁺的處理相比，沒(méi)有明顯的區(qū)別。但當(dāng)Al³⁺濃度為20 mmol/L時(shí)，菌株A4雖然可以生長(zhǎng)，但與其它處理相比，生長(zhǎng)明顯受到抑制，可能由于高濃度Al³⁺對(duì)菌株造成毒性，造成菌株生長(zhǎng)繁殖速度變慢。

2.5 pH對(duì)菌株A4在含Al³⁺培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的影響

當(dāng)pH小于5時(shí)，活性鋁主要以對(duì)土壤生物毒害最普遍的Al³⁺形式存在，所以研究pH≤5.0時(shí)，菌株A4在Al³⁺中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。

結(jié)果表明，起始pH小于3.0時(shí)，菌株在Al³⁺存在條件下，不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)情況較差;起始pH為2.0～4.0時(shí)，pH對(duì)菌株生長(zhǎng)有較大影響;起始pH為4.5～5.0時(shí)，菌株生長(zhǎng)受pH影響較小。

2.6 Al³⁺對(duì)菌株A4耐鋁性的誘導(dǎo)

將分別在無(wú)Al³⁺和Al³⁺環(huán)境下經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接的菌液，分別接種到含0和15 mmol/L Al³⁺的液體S-LB中培養(yǎng)，觀察菌株的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖5。

結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)15 mmol/L Al³⁺誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌株，與在無(wú)Al³⁺條件下前培養(yǎng)的菌株相比，生長(zhǎng)情況并無(wú)明顯差異;菌株A4的耐鋁能力并沒(méi)有經(jīng)過(guò)Al³⁺誘導(dǎo)而有所提升，也未經(jīng)無(wú)Al³⁺處理而有所減弱或消失;耐鋁能力是其固有特性，且可穩(wěn)定遺傳。

3 討論與結(jié)論

中國(guó)酸性土壤面積約占耕地面積的四分之一。活性鋁濃度較高，可對(duì)作物、土壤微生物造成嚴(yán)重毒害;而微生物能夠較早地指示環(huán)境變化，又具有生長(zhǎng)速度較快等特點(diǎn)。因此，可借助耐鋁微生物的吸收、吸附或是其分泌的代謝物對(duì)鋁離子的螯合作用以減輕鋁毒害，這為酸性土壤改良提供了新的途徑;而土壤微生物中細(xì)菌含量最高，遺傳操作較為簡(jiǎn)單，可為耐鋁機(jī)制研究提供合適的模式生物體。

國(guó)內(nèi)外報(bào)道的耐鋁細(xì)菌主要為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）[10]及伯克霍爾德菌（Burkholderia sp.）[12-13]，耐鋁細(xì)菌分離較難[16]。茶樹(shù)是一種耐鋁作物，從茶園土壤中極有可能分離出高效的耐鋁細(xì)菌。因此，本文采集海南茶園酸性土壤，從中分離、鑒定高效耐鋁細(xì)菌，并研究其耐鋁能力及耐鋁特性，以期得到理想的耐鋁微生物資源。

賀根和發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Al³⁺濃度到達(dá)mmol級(jí)時(shí)，酸性土壤環(huán)境中很難分離到耐鋁細(xì)菌[13]。Kimoto等[8]分離出的可耐受約500 mmol/L Al₉（SO₄）。的Acido-cella aluminiidurans，是迄今為止報(bào)道的耐鋁能力最強(qiáng)的細(xì)菌，其余細(xì)菌最高只可耐受74 mmol/LAl³⁺[9]。本文從海南茶園酸性土壤中分離得到2株不同種屬的高效耐鋁細(xì)菌（均可耐受12 mmol/L Al³⁺，其中一株最高可耐受20 mmol/L Al³⁺），耐受能力雖不如已報(bào)道的Acidocella aluminiidurans，但在同一土壤樣品中，分離出多株分類(lèi)地位明顯不同的高效耐鋁（12 mmol/LAl³⁺）細(xì)菌的情況為首次報(bào)道;對(duì)其耐鋁能力及耐鋁特性進(jìn)行了研究，為活性鋁濃度較高的酸性土壤改良提供了資源。

選取2株菌中耐鋁能力較強(qiáng)的菌株A4，進(jìn)一步研究其耐鋁特性，發(fā)現(xiàn)較低濃度的Al³⁺（10 mmol/L）并不會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的促進(jìn)或抑制作用.但在較高濃度的Al³⁺（20 mmol/L）環(huán)境中，生長(zhǎng)受到明顯抑制;菌株A4具有應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，需注意待改良酸性土壤的活性鋁濃度，以免活性鋁濃度過(guò)高影響耐鋁效果。

本文分離鑒定了2株不同種屬的高效耐鋁細(xì)菌，均可耐受12mmol/L Al³⁺，命名為A3、A4，其中菌株A4最高可耐受20 mmol/L Al³⁺。選取耐鋁效果較好的菌株A4，進(jìn)一步研究了其在不同濃度Al³⁺（0、10、20 mmol/L）下的生長(zhǎng)曲線、pH對(duì)其在含Al³⁺培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的影響及Al³⁺對(duì)其耐鋁性的誘導(dǎo)情況，試驗(yàn)結(jié)果可為耐鋁細(xì)菌改良酸性土壤提供良好的菌種資源。

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