耐碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性及其相關影響因素

羅洪英，余水泉

(1.四川省宜賓市第三人民醫院檢驗科 6444000；2.重慶市涪陵區中心醫院檢驗科 408000)

目前細菌的耐藥性隨著醫學科學的發展及臨床實踐中各種主客觀因素的影響作用，已成為全球關注的問題之一，同時也是臨床面臨的新挑戰[1-2]。腸桿菌科細菌與人們的日常生活密切相關，其中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等均為常見的病原菌,并以多重耐藥菌株引起的感染為顯著特點。碳青霉烯類抗菌藥物是目前臨床治療的最常用藥物之一，但近年來隨著其在臨床使用的不斷增加，以及較多的不合理使用，導致出現了碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株。碳青霉烯類耐藥機制包括產碳青霉烯酶、外膜通透性障礙、細菌生物膜的形成、整合子的介導等，其中產碳青霉烯酶和外膜通透性障礙是對碳青霉烯類耐藥最主要的特征[3-5]。現探討碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥情況，以及耐碳青霉烯類腸桿菌科產碳青霉烯酶、整合子分布、外膜孔蛋白的缺失情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集宜賓市第三人民醫院2014年2月至2016年8月各個科室患者的痰液、尿液、分泌物、血液等標本，對87株耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細菌(CRE)菌株進行研究。

1.2方法 菌株鑒定按照原衛生部《全國臨床檢驗操作規程(第3版)》標準。采用VITEK-2 Compact全自動細菌分析鑒定系統(法國生物梅里埃公司),藥敏檢測使用抗菌藥物紙片(英國Oxoid公司)，藥敏紙片使用紙片擴散法；質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603,依照2007年CLSI制定的標準，使用推薦的折點判斷耐藥性。應用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測常見碳青霉烯酶基因并描述分布特征，使用煮沸法制備菌株模板后，運用25 μL反應體系，PCR擴增KPC、NDM-1(中國疾病預防控制中心傳染預防控制所推薦)基因序列，引物序列(NDM-1：正義鏈5′-CAG CAC ACT TCC TAT CTC-3′,反義鏈5′-CCG CAA CCA TCC CCT CTT -3′;KPC：正義鏈5′-TGR AAG TTA CCG CGC TGA GG-3′,反義鏈5′-CCA GAC GAC GGC ATA GTC AT-3′),反應過程：95 ℃預變性10 min后變性30 s，退火55 ℃和52 ℃均30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環。產物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldviewⅠ型核酸染色劑染色，紫外燈下觀察結果。對整合子分布特征進行總結分析，PCR檢測體系同上，引物(整合子1：正義鏈5′-GGT CAA GGA TCT GGA TTT CG-3′,反義鏈5′-ACA TCG GTC TAA ATC ATC GTC-3′；整合子2：正義鏈5′-CAC GGA TAT GCG ACA AAA AGG T-3′,反義鏈5′-GTA GCA AAC GAG TGA CGA AAT G-3′；整合子3：正義鏈5′-AGT GGG TGG CGA ATG AGT G-3′,反義鏈5′-TGT TCT TGT ATC GGC AGG TG-3′)；與此同時還通過電泳對外膜孔蛋白的缺失情況進行分析。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較應用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE菌株產碳青霉烯酶情況 87株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE菌株進行PCR擴增碳青霉烯酶基因,檢出碳青霉烯酶基因74株，占85.06%。包括肺炎克雷伯菌65株，占87.84%，大腸埃希菌檢出6株(8.11%)，陰溝腸桿菌、產酸克雷伯菌、產氣腸桿菌各檢出1株，分別占1.35%。見表1。PCR圖譜以大腸埃希菌進行分析。見圖1。

表1 耐碳青霉烯類抗菌藥物的CRE菌株產碳青霉烯酶的分布特征

注：M表示DNA 標記物；P表示陽性；N表示陰性

圖1大腸埃希菌PCR圖譜

2.2耐碳青霉烯類CRE菌株表型耐藥情況 74株分離菌中檢測出攜帶KPC型碳青霉烯酶基因33株，陽性檢出率為44.59%。未檢測到NDM-1基因。

2.3對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE菌株整合子情況 Ⅰ類整合子共檢出52株，檢出率為59.77%(52/87),其中47株來自產碳青霉烯酶菌株，5株為非產碳青霉烯酶菌株，同時均以肺炎克雷伯菌檢出的比例最高(分別為39株和3株)；Ⅱ類整合子檢出共8株，檢出率為9.20%(8/87),其中4株來自產碳青霉烯酶的菌株，4株為非產碳青霉烯酶菌株;未檢出Ⅲ類整合子。Ⅰ類和Ⅱ類整合子檢出3株，2株來自產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株，1株為非產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株。見表2。

表2 對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE菌株整合子的分布特征(n)

2.4對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌外膜孔蛋白缺失情況 對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥比例較高的肺炎克雷伯菌，菌株外膜孔蛋白缺失結果顯示，共70株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌株中,膜蛋白無異常達18.57%，其中產碳青霉烯酶菌株中膜蛋白無異常為16.92%；OmpK35表達下調菌株占24.29%，OmpK35缺失占10.00%；OmpK36表達下調和缺失的比例分別為4.23%和57.14%；產碳青霉烯酶菌株中OmpK35表達下調的菌株占50.77%，OmpK35缺失占9.23%；OmpK36表達下調和缺失的比例分別為3.08%和55.38%。見表3和圖2。

表3 對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌株外膜孔蛋白缺失情況[n(%)]

注：M表示標準蛋白質分子

圖2孔膜蛋白電泳圖

3 討 論

近年來,抗菌藥物廣泛應用于臨床抗感染，細菌在抗菌藥物的選擇壓力下，耐藥性也逐漸表現出來[6-8]。亞胺培南或美洛培南抗菌藥物是目前臨床特異性強、效果良好的藥物，但目前耐碳青霉烯類桿菌的分離率也逐年升高，主要耐藥菌株常見一些革蘭陰性桿菌，同時也是引起臨床感染最常見的細菌類型，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌屬等，以及非發酵革蘭陰性桿菌(銅綠假單胞菌、不動桿菌屬等)。細菌的耐藥性之所以能在抗菌藥物出現之后迅速產生，并且擴散，主要原因之一與基因水平轉移密切相關，細菌的耐藥基因多位于質粒、轉座子、整合子等區域，現研究臨床桿菌的相關機制，對指導臨床合理使用抗菌藥物意義重大[9-11]。

本研究對87株耐碳青霉烯類抗菌藥物的CRE菌株進行PCR擴增碳青霉烯酶基因,檢出碳青霉烯酶基因74株(85.06%)，其中包括肺炎克雷伯菌65株，占87.84%，大腸埃希菌檢出6株(8.11%)，陰溝腸桿菌、產酸克雷伯菌、產氣腸桿菌各1株，分別占1.35%。該耐藥機制的研究近年來早已成為微生物領域的又一個關注焦點[8，12]，其相關機制除了與上述碳青霉烯酶基因的表達有關外，還與整合酶基因相關。本研究整合酶基因檢測結果表明，Ⅰ類整合子共檢出52株，檢出率59.77%(52/87),其中47株來自產碳青霉烯酶菌株，5株為非產碳青霉烯酶菌株，同時均以肺炎克雷伯菌檢出的比例最高(分別為39株和3株)；Ⅱ類整合子檢出8株，檢出率9.20%(8/87),其中4株來自產碳青霉烯酶菌株，4株為非產碳青霉烯酶菌株;未檢出Ⅲ類整合子。Ⅰ、Ⅱ類整合子檢出3株，2株來自產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株，1株為非產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株。

近年來的研究提示，產生ESBL和AMPC酶的同時合并外膜孔蛋白缺失現象的菌株也可導致耐藥作用。外膜孔蛋白表達減低或者缺失對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥作用起著重要的作用，特別是OmpK35、OmpK36、OmpK37,使用抗菌藥物治療的同時，不少菌株會產生下調這些孔蛋白表達的作用，或者誘導其缺失[13-15]。本研究結果顯示，70株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌株中,膜蛋白無異常達18.57%，其中產碳青霉烯酶菌株中膜蛋白無異常為16.92%；OmpK35表達下調菌株占24.29%，OmpK35缺失占10.00%；OmpK36表達下調和缺失的比例分別為4.23%和57.14%；產碳青霉烯酶菌株中OmpK35表達下調的菌株占50.77%，OmpK35缺失占9.23%；OmpK36表達下調和缺失的比例分別為3.08%和55.38%。碳青酶烯酶是能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物的β-內酰胺酶，其包括Ambler分子分類為A、B、C、D的4類酶，其中C類酶，即頭孢菌素酶僅水解頭孢菌素而不水解碳青霉烯；肺炎克雷伯菌碳青酶烯酶是目前引起CRE對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因，其基因位于可移動的質粒上，幾乎可以水解除頭孢菌素類以外的所有β-內酰胺類抗菌藥物，包括碳青霉烯類。而與此同時，產碳青酶烯酶肺炎克雷伯菌可通過質粒、整合子、插入序列的基因元件進行水平傳播使其他細菌獲得耐藥性。耐碳青霉烯類腸桿菌與產碳青霉烯酶、整合子、外膜孔蛋白均存在相互關聯，且這些機制本身又存在不同程度的協同等作用，本研究結果也說明了其間的復雜相關性。

綜上所述，對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE耐藥情況嚴峻，且肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因檢出率最高，耐藥最嚴重；耐藥性的發生還與整合酶基因Ⅰ類整合子，以及孔膜蛋白表達減低與缺失密切相關。本研究擬為新型抗菌藥物的研發提供一些理論支持，為預防抗菌藥物耐藥性的產生提供依據。

[1]張麗，朱元祺，張小兵，等．耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥基因檢測[J]．中華醫院感染學雜志，2014，24(23)：5734-5736．

[2]趙慧錚，師志云，李剛，等．耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥性分析與分子流行病學研究[J]．中華醫院感染學雜志，2016，26(3)：494-497．

[3]陳剛，茹納丹，翁幸鐾．耐碳青霉烯類鮑氏不動桿菌β-內酰胺酶與膜孔蛋白carO、oprD基因研究[J]．中華醫院感染學雜志，2014，24(15)：3641-3644．

[4]李淵婷,金鳳玲.腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制及臨床治療進展[J].中國感染控制雜志,2015,14(9):644-648.

[5]王煒，蘇建榮．銅綠假單胞菌碳青霉烯酶耐藥的機制研究[J]．臨床和實驗醫學雜志，2014，13(8)：610-613．

[6]李軍，鄒明祥，王海晨，等．耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥機制的研究[J]．中華醫院感染學雜志，2016，26(21)：4801-4804．

[7]張傳明．碳青霉烯非敏感大腸埃希菌耐藥機制初步研究及分子流行病學調查[D]．重慶：重慶醫科大學，2015．

[8]楊秋,陸文婷,芮勇宇.耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌耐藥機制及分子流行病學研究[J].實用醫學雜志,2015,12(24):4129-4132.

[9]梁權輝，徐韞健．耐碳青霉烯肺克雷伯菌和大腸埃希菌耐藥機制研究[J]．國際檢驗醫學雜志，2014，35(2)：165-167．

[10]解春寶，喻華，肖代雯，等．一株對3種碳青霉烯類抗菌藥物均耐藥的肺炎克雷伯菌耐藥機制研究[J]．檢驗醫學，2014，29(4)：369-374．

[11]劉萍，閆雪苗，張堅磊，等．23株耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥基因分析[J]．山東醫藥，2016，56(24)：91-93．

[12]劉淑敏，許云敏，牛敏，等．急診重癥監護病房耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌的分子流行特征[J]．中國感染與化療雜志，2015，15(4)：372-376．

[13]代強，鄭波．2012美國疾病預防控制中心耐碳青霉烯類腸桿菌控制指南簡介[J/CD]．中國醫學前沿雜志(電子版)，2013，5(8)：30-31．

[14]楊勇文,李從榮.耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥基因研究進展[J].山東醫藥,2016,56(2):96-98.

[15]徐麗英，丁卉，陳麗燕，等．30株耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌的調查分析[J]．中華醫院感染學雜志，2012，22(12)：2678-2680．