擬南芥耐硒突變體的鑒定及基因定位

陳大清+鐘育海+李應生

摘要：在硒鹽脅迫下通過根彎曲特性篩選獲得擬南芥（Arabidopsis thaliana）耐硒突變體，并以突變體為母本與野生型（Ler）雜交獲得基因型完全雜合的F1代；自交產生的F2代硒敏感，硒耐受的分離比為3∶1，表明該突變體是隱性單基因遺傳。F2代選出132株具有耐硒特性的植株作為圖位克隆的群體，從應用SSLP和In/Del分子標記進行基因定位，通過分析目的基因與各分子標記之間的連鎖關系，發現耐硒突變體基因位于第I號染色體F12P19和NGA111的分子標記之間。

關鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）；硒鹽脅迫；突變體；基因定位

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）02-0115-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.029

Abstract： A selenate-torlerance arabidopsis mutant was obtained by using the root-bending trait under selenate stress. It was conformed that the selenate resistant characteristics could be steady inheritance. Then this mutant was crossed with the wild-type Ler. and F1 generation were created with heterozygous type completely. The F2 crossed by theirself were expressed the separation ratio of 3∶1 in response of sensitive selenium to resistent selenium，It were suggested that this mutant was a monogenic recessive mutation. Map-based cloning population were composed of the 132 selenate-tolerance seedlings in F2 generation. Using SSLP and In/Del based on PCR to preliminary chromosomal location. Through linkage analysis，it's indicated that this mutant gene was located on the chromosome I，which was mapped between molecular marker F12P19 and NGA111.

Key words： Arabidopsis thaliana； selenate stress； mutant； gene lacation

微量元素硒（Se）不僅是人、動物和微生物的必需營養元素，也是植物生長發育的有益元素[1，2]。植物中的硒含量從每千克干重數微克到數克[3]，為研究植物硒代謝提供了潛在的遺傳資源。關于植物硒代謝與積累已有許多學者從不同方面進行系統評述[4-8]。硒耐受關聯突變體通過T-DNA插入法，結合應用擬南芥基因組序列的分析，分離到了mmt突變體[9]，從擬南芥中獲得了由于硫轉運體基因損害的突變體[10]。Zhang等[11，12]發現不同生態型擬南芥之間存在硒的耐受性差異，通過數量性狀作圖分析確定了擬南芥中不同染色體上的硒耐受相關遺傳位點。19種擬南芥材料的硒耐受和積累的變異已經鑒定[13]。據分析，在擬南芥中參與硫的吸收與轉運的基因家族至少有14個[14]。Kassis等[15]通過篩選T-DNA插入突變體庫獲得了硫轉運體基因（SULTR1；2）功能缺失但卻耐硒的變異株（sel1-11）。Tamaoki等[16]測定了Columbia（Col-0）和Wassilewskija（Ws-2）的對亞硒酸鹽的耐受指數，依據芯片和半定量PCR分析比較了二者對硒耐受的生理和分子響應機理的差異。Zhao等[17]應用水稻硅轉運體突變體材料研究發現硅的內流轉運體（OsNIP2；1）與亞硒酸鹽的滲透吸收相關聯，這是迄今在植物中首次鑒定出的亞硒酸鹽轉運體。植物耐硒相關的突變體主要是硫轉運體基因功能缺失（損傷）或某些硒同化代謝關鍵酶基因的插入失活所致，但涉及亞硒酸鹽耐受突變體仍然少見。由于硒代謝積累的復雜性，創造和利用新的突變體和芯片分析及基因組學分析是揭示其機理的有效途徑。中國的硒分布不平衡，開發利用富硒資源具有必要性和迫切性，但富硒強化食品開發極需從代謝機制上進行科學闡釋和規范，加強對植物硒代謝積累的研究對指導食品硒營養的分子改良具有重要理論和實踐意義。此外耐硒功能基因的開發將有助于培育超富集硒的轉基因速生植物，為環境硒污染植物治理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia和Landsberg生態型；突變體通過EMS誘導，在亞硒酸鹽脅迫下，對100多萬粒誘變種子通過根彎曲特征鑒定篩選出的耐硒突變株。

1.2 突變體耐受穩定性試驗

將培養皿中培養5～6 d的幼苗（根長約1.0～1.5 cm）從培養室中取出，揭開皿蓋，用小鈍頭鑷輕輕夾住一片子葉，小心地將生長于平板上的幼苗抽出，避免傷及下胚軸和根。然后將突變體和野生型的幼苗分別轉移至含Na2SeO4選擇培養基中，于培養架上倒置垂直培養。第6天觀察根彎曲程度并測量根負向地性生長量，統計并計算其平均值，評估突變體的耐硒特性，連續培養到M5代。endprint

1.3 突變體的遺傳特性

在Na2SeO4選擇培養基上通過根彎曲試驗分別鑒定F1和F2代的根彎曲情況，統計分析F2代的分離比。

1.4 突變體耐硒基因的定位

采用F1自交產生的F2為作圖群體。F2代于38 mg/L的Na2SeO4選擇培養基篩選，出現性狀分離，將帶有耐硒目的基因純合植株挑選出來后移植到蛭石中培養；20 d后，用挑選出來的突變體葉片提取基因組DNA（CTAB法）。參考（www.arabidopsis.org），選擇了20個SSLP分子標記，使其按間距為20-35 cM平均分布于擬南芥5條染色體上，同時利用數據庫和軟件設計In/Del分子標記引物，用于進一步連鎖分析。

2 結果與分析

2.1 M3代根彎曲特性比較

從表1可以看出，以野生型Col-0根負向地性生長量指標為參照，M3代12個株系中M3-6、M3-11硒耐受性不明顯；M3-12達到顯著水平，表現為硒耐受性；M3-5、M3-9、M3-10、M3-4、M3-1、M3-3、M3-2、M3-7、M3-8都達到了極顯著水平，且根負向地性生長量平均值較高，遠遠高于野生型，耐硒特性十分明顯。其中M3-8株系根負向地性生長量最高（7.94 mm），是野生型的2.13倍，同時，M3-8株系植株的根彎曲均一，選取根彎曲程度最明顯的植株M3-8-4、M3-8-5、M3-8-11、M3-8-14自交繁殖（圖1），至種子成熟后單株收種，作為進一步檢驗的材料。

在此基礎上連續進行M4、M5代的耐硒穩定性比較（結果未列出），表明M3-8株系是能穩定遺傳的耐硒突變體，適合開展基因定位工作。

2.2 突變體顯隱性分析

圖2所示為突變體與Landsberg雜交后的F1代，圖3顯示為F1代和Col-0、Ler的基因組DNA經特異引物擴增后的電泳檢測結果，表明基因型為雜合型，說明雜交是成功的，可以繼續用于遺傳規律分析[2]。

將收獲的F2代種子在含38 mg/L的Na2SeO4選擇培養基上測試其表現型，在觀察的580株F2代群體中，對硒耐受的敏感型和不敏感型分離比接近 3∶1。用χ2對其分離比做適合性測驗見表2，符合孟德爾遺傳規律，可以初步判斷該突變體是由隱性單基因控制。

從圖4可以看出，在被檢測的群體中，大部分為C帶型，少數樣品表現為H帶型和L帶型。由于在突變位點附近，大部分的突變體都沒有發生交換，因此突變位點附近的分子標記與突變體遺傳背景一致的原始親本Col-0連鎖，PCR電泳的帶型與Col-0一樣，都為C帶型[3]。而其他非突變位點，突變體大部分都發生了交換，在該位點上表現出既有Ler野生型，又有Col-0野生型的特征，表現為電泳結果就是C和L兩條帶（雜合帶）。由此推測該突變基因與NGA280分子標記可能存在連鎖關系。

在NGA280上、下游分別尋找分子標記位點，根據NGA280和NGA111對132個作圖群體的擴增結果判斷，發現NGA111與突變基因之間之緊密連鎖，突變基因的物理位置應位于這兩個分子標記之間，且靠近NGA111，檢測指向NGA280下游的F12P19（位置：94.50 cM），同樣對132個作圖群體進行了PCR擴增檢測統計分離比例，其重組率為12.12%。NGA63、NGA280、F12P19和NGA111 4個分子標記在第I號染色體的位置分別為11.48、83.83、94.50和115.55 cM（表3）。在NGA280、F12P19和NGA111 3個分子標記的擴增結果中，有些個體表現為雜合型（H），少數個體表現非原始親本的型（L），大多數個體為原始親本型（C），提示突變基因與這些分子標記的連鎖較為緊密。但NGA63的重組率接近50%，與突變位點的遺傳距離相對較遠，因此可以初步判斷突變基因位于擬南芥第I號染色體上，與分子標記F12P19和NGA111緊密連鎖（圖5、表3）。

3 討論

突變體（M3-8）繁殖自交后代均表現出硒耐受性，檢測到M5代也表現穩定系耐受特性，表明該突變性狀能夠穩定遺傳。突變體和野生型Ler雜交，F1代表現為硒敏感性，F2代野生型和突變體的性狀分離比為3∶1，提示該突變是單基因隱性突變。這樣可以直接從子二代中選出純合的突變體，利用F2中純合的突變體構成作圖群體，開展基因定位克隆。NCBI和Tair數據庫搜尋結果顯示，登錄擬南芥第I號染色體的硒關聯基因分別是SULTR1；2（At1g78000）、AtCpNifS（At1g08490、APR2（At1g62180）、SAT5（At1g

55920）、APS2（At1g19920）和CGS（At1g33320）等。篩選的突變基因位于擬南芥的第I號染色體的分子標記F12P19和NGA111之間（95～115 cM），在此區間尚未發現耐硒關聯基因的報道，提示該耐硒突變體可能是一個新的硒耐受基因，開展基因克隆和關聯功能分析具有理論和實踐意義。

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