畬藥山里黃根水提液對CCl4體外誘導L-02肝損傷作用有效部位篩選

傅躍青 俞忠明 單云崗

畬藥山里黃根為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥根，具有清熱、涼血、解毒作用[1]，在浙江、福建、廣東、廣西、湖南等地應用極廣，主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病癥的治療，有較好的開發利用前景[2-3]。四氯化碳（CCl4）是一種強烈的能夠引起肝細胞壞死的化合物，一直被研究者用來誘發各種肝損傷模型，利用肝損傷以后藥物對于肝細胞的作用以闡明實驗藥物的肝毒性機制或肝損傷保護機制[4-7]。含有山里黃根的中藥制劑在治療肝病方面的療效尤為顯著[8]，對損傷的肝細胞有一定的保護作用。我們通過山里黃根不同極性萃取部位的對水提液CCl4體外誘導L-02肝細胞損傷模型的保護作用進行實驗研究，采用MTT法[9-11]測定細胞OD值并統計細胞存活率，作為判斷山里黃根不同極性萃取部位水提液對于CCl4體外誘導L-02肝損傷作用的重要指標，從而初步篩選出具有肝保護作用的藥物有效部位。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞及培養條件 實驗用肝細胞株：L-02人正常肝細胞，由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供，培養于含10%胎牛血清的DMEM中，均在37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養，2～3d傳一代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2 藥物及主要試劑 山里黃根采自浙江麗水市蓮都區天堂山，由浙江中醫藥大學陳錫林教授鑒定。陽性對照藥：聯苯雙酯片（浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，批號150601）。CCl4（中國醫藥集團上海化學試劑公司，批號：W20150513）；石油醚（杭州石化有限責任公司，批號20150704）；乙酸乙酯（杭州雙林化工試劑廠，批號20150515）；正丁醇（杭州雙林化工試劑廠，批號20150508）；DMEM培養液（南京凱基生物技術發展有限公司，批號20150318）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號20150207）；0.25%胰酶-EDTA溶液（南京凱基生物技術發展有限公司，批號 20150210）；二甲基亞砜（DMSO，上海凌峰化學試劑有限公司，批號20151205）；細胞級（DMSO，美國 Sigma公司，批號 GNM25200）；DHank’s液（南京凱基生物技術發展有限公司，批號20151211）；四甲基偶氮唑藍（MTT,美國Sigma公司）。

1.3 實驗儀器 細胞培養板（美國Corning Costar公司）；細胞培養瓶（美國Corning Costar公司）；311型 CO2培養箱（Thermo Electron Corporation，USA）；TD4臺式低速離心機（鹽城市凱特實驗儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；SO9001電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；Power Wave X340 BIO-TEK酶標儀（美國BIO-TEK儀器有限公司）；高壓滅菌鍋（上海華線醫用核子儀器有限公司）；HWS24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器設備有限公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；Eclipse TS100/100-F倒置顯微鏡（日本Nikon）；Phs-3E Ph計（上海精科有限公司）；DEF-6050真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.4 主要試劑的配制 （1）DMEM培養基：分別將DMEM干粉40.2g、NaHCO311.1g、青霉素G鈉鹽30萬IU、硫酸鏈霉素0.3g溶于3000mL雙蒸水中，置磁力攪拌器上使其全部溶解，用0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃保存，用前 37℃融化，置 4℃備用；（2）0.25%胰蛋白酶：將0.25g胰蛋白酶用D-Hank’s液溶解，定容至100mL，置磁力攪拌器上使其全部溶解，用5.6%NaHCO3調整pH值在7.2～7.6之間，用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝成5mL/瓶，-20℃保存，用前室溫融化，置4℃備用；（3）PBS：分別精密稱取0.20g KCl，0.24g KH2PO4，8.0g NaCl，3.58g Na2HPO4·12H2O，將以上試劑溶于適量雙蒸水中，置磁力攪拌器上使其全部溶解，定容至1000mL，NaOH調整pH值為7.2，高壓蒸氣滅菌，放冷后置4℃備用；（4）MTT溶液：精密稱取MTT 0.5g，用無胎牛血清的DMEM培養液配成5mg/ml的溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，放4℃鋁箔紙包住避光保存。

2 實驗方法

2.1 山里黃根水提液的四個不同極性部位的提取

（1）工藝路線如下：將山里黃根干燥藥材粉碎成粗粉（過2號篩），稱取，加入蒸餾水，加熱回流提取2次，料液比分別為1:20和1:10，每次1h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至黏稠狀。分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取至無色，將萃取物及萃取后剩余水層減壓抽濾回收溶劑，分別放入真空干燥箱中加壓干燥成干膏，分別得到石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、剩余部位組。重復以上步驟，提取濃縮干燥成干膏，得到總提取物組。精密稱量，計算以上5種干膏得率。（2）細胞液培養：用胎牛血清配制成含12%胎牛血清的的高糖DMEM培養液溶解，及20%胎牛血清的的高糖DMEM培養液。

2.2 L-02肝細胞的培養 （1）傳代培養：將L-02肝細胞株凍存管從-80℃超低溫冰箱中取出，立即放入37℃水浴鍋中，持續搖晃，將冷存液速度融化，馬上加入到10倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養基中（已提前于37℃預溫），顛倒混勻，離心，棄上清，將沉淀細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基重新懸浮，置于CO2培養箱中培養，隔天換液，細胞長滿后，胰酶消化，傳代備用。（2）鋪板：將處于對數生長期的L-02肝細胞用0.25%胰蛋白酶消化，然后用含10%胎牛血清的DMEM培養基懸浮，用玻璃管輕輕吹打成單細胞懸液，倒置顯微鏡下用細胞計數板技數，調整細胞濃度為5×104個/mL。將細胞接種于96孔板中，每孔 100μL，置于 5%CO2培養箱（37℃）內培養24h。

2.3 CCl4損傷模型的建立 吸取CCl4溶于適量DMEM培養基中，以少量的二甲基亞砜助溶，二甲基亞砜終濃度為0.1%（V/V），配成終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40mmol/L 的 CCl4溶液。加入到細胞貼壁后的96孔板中，每個濃度設6個復孔（需要經過預實驗，通過細胞抑制率結果，確定一定的濃度范圍，以確定造模的成功性）。

2.4 MTT檢測 培養24h后，倒掉培養基，PBS洗板1次，每孔加入100μL終濃度為0.5mg/mL的MTT溶液，無血清培養基稀釋。培養箱繼續培養4h后，倒掉MTT溶液，每孔加入150μL二甲基亞砜，充分震蕩15min，于酶標儀570nm處檢測OD值（需要預實驗，通過實驗確定山里黃根水提液與MTT不反應）。

2.5 計算公式 各平行孔取均值后計算，公式如下：細胞相對存活率計算：（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%；細胞相對抑制率計算：1-（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

2.6 實驗分組 正常對照組，使用時用無胎牛血清的高糖DMEM培養液溶解，加入細胞級DMSO助溶，用0.22μm濾膜過濾除菌，每組設6個復孔，每孔加入細胞液。模型組，終濃度為5mmol/L CCl4，方法參照上文CCl4損傷模型的建立。乙酸乙酯+CCl4造模實驗組，使用時用無胎牛血清的高糖DMEM培養液溶解，加入細胞級DMSO助溶，用0.22μm濾膜過濾除菌，加入到CCl4損傷細胞液中，使藥液在96孔板中的終濃度為 100、300、600、1200、2400μg/mL。37℃培養箱培養24h。正丁醇+CCl4造模實驗組、剩余部位+CCl4造模實驗組、總提取物+CCl4造模實驗組方法同正丁醇+CCl4造模實驗組陽性對照組（聯苯雙脂片），用無胎牛血清的高糖DMEM培養液溶解，加入細胞級二甲基亞砜助溶，用0.22μm濾膜過濾除菌，加入到CCl4損傷細胞液中，使藥液在96孔板中的終濃度為 5、10、20、30、40μg/mL。37℃培養箱培養 24h。

2.7 統計學方法應用SPSS13.0分析應用軟件處理分析數據，實驗數據均以（x±s）表示。各組間比較均采用單因素方差分析，組間樣本比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 山里黃根水提液不同萃取部位干膏得率 精密稱取山里黃根干燥根粗粉（過2號篩）200g，按照上文2.1（1）項的方法提取分離干燥后，所得干膏得率如表1所示。由于石油醚萃取部位所得干膏比較少，不足以實驗使用，所以后面的細胞實驗把石油醚部位棄去。

3.2 CCl4損傷L-02肝細胞模型的建立 CCl4濃度在0.5～40.0mmol范圍內，隨CCl4濃度增加，L-02肝細胞存活率降低。擬合細胞存活抑制率與CCl4劑量的量效關系曲線（圖1），可以清晰看出濃度越高抑制率越高，即存活率越低。研究表明，細胞存活率在50%～60%之間，可很好地顯示CCl4肝細胞的損傷與保護作用的差異。通過表2我們發現，與正常對照組比較，CCl4濃度為5mmol/L時，MTT法檢測OD值，得到肝細胞的抑制率為51.98%，細胞存活率為48.02%。因此，實驗選取5mmol/L CCl4作用24h作為L-02肝細胞損傷模型的造模劑量。

表1 山里黃根水提液不同萃取部位干膏得率

圖1 CCl4不同濃度對L-02肝細胞抑制率的影響

表2 不同濃度CCl4對細胞增殖的影響（x±s）

3.3 山里黃根水提液不同萃取部位對CCl4造模細胞增殖的影響及有效部位的確定 根據上述各部位提取物LD1和預實驗結果，每個提取物設定5～6個劑量，篩選對CCl4損傷L-02肝細胞具有保護作用的部位。結果表明：用MTT法檢測山里黃根水提液不同萃取部位及總提取物對CCl4造模細胞增殖的作用，不同部位呈現了抑制或者促進作用（見表3）。其中對細胞有促進作用的是正丁醇提取部位，在600、1200、2400μg/mL濃度時對細胞有明顯的促進生長作用且有意義（P＜0.05），即細胞存活率升高。在1200μg/mL濃度時總提取部位對細胞生長也有促進作用，可以表明山里黃根水提液對CCl4體外誘導L-02肝損傷有一定的保護作用，而保護作用明顯的是正丁醇部位。

表3 各組對CCl4損傷細胞存活率的影響（x±s）

4 討論

有效部位的篩選是研究藥物作用機制的一個重要環節，是研究和開發新藥的必經途徑。山里黃根水提液對損傷的肝細胞有一定的保護作用，因此我們通過CCl4體外誘導L-02肝細胞損傷，而藥物作用可以使細胞生長或者凋亡，通過測定細胞數量的變化來初步篩選具有肝保護作用的藥物。目前檢測細胞數量變化的方法有很多，如同位素法、摻入法等都具有靈敏度高、穩定性好的特點，但是由于步驟復雜需要特殊設備等，不能普遍使用。目前最常用的就是MTT法，該法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選以及細胞毒性試驗等。

MTT方法具有靈敏度高、穩定性好、操作簡單等特點。MTT法利用96孔板可簡便快捷規模化的篩選藥物。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長（也可選擇570nm）處測定其光吸收值OD值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。所以缺點就是甲瓚影響實驗結果準確性。所以實驗過程中，細胞點板時一定要吹打均勻，盡量減少誤差，千萬不能把藍紫色甲瓚結晶析出，否則會加大結果誤差。

畬藥山里黃根的干燥根作為新品種被收錄進《浙江省中藥炮制規范》，并注明其功能為清熱、涼血、解毒，臨床上主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病癥的治療，表現出較好的開發利用前景，值得關注并深入研究。

本研究采用系統溶劑法對山里黃根水提液進行了不同極性部位的萃取，一共得到了四個部位，但是由于石油醚部位的干膏得率過低（0.042%），因此不能用于實驗，考慮到藥物本身對于MTT的影響，實驗前做了MTT法測山里黃根水提液，沒有反應，所以實驗中沒有設置藥物顏色對照組。

本研究以L-02細胞株建立CCl4損傷模型，測定了山里黃根不同部位提取物的毒性，明確了各提取物的安全劑量范圍，篩選出抗L-02細胞株CCl4損傷的有效部位——山里黃根水提液中正丁醇萃取部位，計算出ED50和TI。該提取物可提高CCl4損傷L-02細胞存活率，是山里黃根中具有保護肝損傷的有效部位。值得我們關注的是，正丁醇萃取部位600μg/mL時保護作用最好，隨著濃度的增大細胞存活率下降，所以可以判斷濃度與細胞存活率沒有依從關系，因此最適濃度是我們進一步研究的問題之一。此外，總提取物組在濃度1200μg/mL時具有保護作用，可能由于相同濃度下正丁醇部位的成分含量少，所以細胞存活率相對較低。因此，在以后的研究中，我們將繼續考察正丁醇部位在藥物作用的不同時間，如藥物作用24、48、72h后，細胞存活率的變化。研究正丁醇部位對受損肝細胞保護作用與藥物作用時間變化的關系。該有效部位提取物抗CCl4損傷的機制以及在體內實驗中發揮作用的具體機制仍需更進一步的研究。

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