報告基因法測定聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學活性的研究

裴德寧+于雷+郭瑩

[摘要] 目的 考察《中國藥典》（2015年版）中報告基因法測定聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學活性的方法適用性。 方法 根據ICH指導原則，驗證報告基因法的專屬性、線性、準確性（回收率）、精密度（重復性、中間精密度）等指標，并對報告基因法與病毒抑制法的測定結果進行比較。 結果 使用報告基因法測定聚乙二醇Ⅰ型干擾素活性具有良好的專屬性，劑量反應關系符合四參數方程，回收率為85%～115%，重復性為6.66%～7.70%，不同測定日期、不同實驗員和不同細胞代次的中間精密度分別為10.64%～11.01%、13.04%～15.12%和7.61%～8.54%，報告基因法與病毒抑制法的測定結果差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 報告基因法可以用于聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學活性測定。

[關鍵詞] 聚乙二醇化Ⅰ型干擾素；生物學活性；報告基因法；方法學驗證

[中圖分類號] R978.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（a）-0022-04

[Abstract] Objective To investigate the applicability of reporter gene assay in Chinese Pharmacopoeia （2015 edition） for determination of the bioactivity of polyethylene glycol （PEG） type Ⅰ interferon. Methods According to ICH guidelines， specificity， linearity， accuracy （recovery） and precision （repeatability and intermediate precisions） of reporter gene assay were validated. The determination results of reporter gene assay and cytopathic inhibition assay were also compared. Results Application of reporter gene assay for determination of the bioactivity of PEG type Ⅰ interferon had good specificity， the dose-response of which was fitted to 4-parameter logistic model. The recovery rate was 85%-115%， the repeatability of the assay was 6.66%-7.70%. The intermediate precision of different dates， laboratory technicians and cell passages was 10.64%-11.01%， 13.04%-15.12% and 7.61%-8.54% respectively. The difference of the determination results between reporter gene assay and cytopathic inhibition assay was not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion The reporter gene assay is applicable for bioactivity determination of PEG type Ⅰ interferon.

[Key words] Polyethylene glycol type Ⅰ interferon； Bioactivity； Reporter gene assay； Methodology validation

干擾素是脊椎動物受干擾素誘生劑作用后合成的一類具有細胞功能調節作用的蛋白，根據受體、結構、來源的不同，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三型，Ⅰ型干擾素包括α、β、ε、τ、ω、κ等亞型[1-3]。聚乙二醇化Ⅰ型干擾素是將Ⅰ型干擾素分子與聚乙二醇（PEG）分子通過共價鍵連接形成的化學修飾蛋白藥物，具有給藥次數少、血藥濃度波動低、治療效果好等優點。目前已上市的品種有聚乙二醇干擾素α2a、聚乙二醇干擾素α2b等，聚乙二醇化Ⅰ型干擾素的分子結構、理化特性、生物學活性與Ⅰ型干擾素相比均有顯著差異[4-6]。

報告基因法是通過檢測報告基因的表達來評價蛋白與蛋白之間或蛋白與細胞之間作用的方法。使用報告基因法測定干擾素生物學活性與經典的細胞病變抑制法相比具有以下幾方面的優勢：精密度高，耗時短，操作簡便，不使用病毒，無需在生物安全實驗室操作[7]，《中國藥典》三部（2015年版）[8]已將其收錄，用于Ⅰ型干擾素生物學活性的測定。為了研究聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學活性能否使用報告基因法進行測定，本研究將從專屬性、線性、準確性、精密度等方面進行方法學驗證。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

標準品：聚乙二醇干擾素α2b工作標準品（批號：J20130018WS，規格：1.04×107 U/mL），供試品：聚乙二醇干擾素α2b注射液3批（批號：201609JS04，規格：3.3×105 U/0.5 mL；批號：201609JS01，規格：5.0×105 U/0.5 mL；批號：201610JS11規格：6.6×105 U/0.5 mL）；Y型聚乙二醇（批號：20160201，規格：100 mg/支）；第3代HEK293puroISRE-Luc細胞、第5代人羊膜細胞（WISH細胞）、第3代水泡性口炎病毒均為中國食品藥品檢定研究院重組藥物室保存；M5型酶標儀，購自MD公司；Softmax軟件，購自MD公司；Bright-GloTM熒光素酶檢測系統，購自Promega公司。endprint

1.2 方法

1.2.1 報告基因法

取標準品，用測定培養液（含有10%胎牛血清的MEM培養基）稀釋至每1 mL約含10 000 U，在96孔細胞培養板中做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。取供試品，用測定培養液稀釋成每1 mL約含10 000 U，在96孔細胞培養板中做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。HEK293 puroISRE-Luc細胞在完全培養液（含有10%胎牛血清、2 μg/mL嘌呤霉素的MEM培養基）中貼壁生長，按1∶4傳代，每周2～3次。取培養的細胞棄去培養液，用PBS洗1次后消化和收集細胞，用測定培養液配制成每1 mL含3.5×105～4.5×105個細胞的細胞懸液。將配制完成的標準品溶液和供試品溶液移入96孔細胞培養板中，每孔加入100 μL，然后將上述細胞懸液接種于同一96孔細胞培養板中，每孔100 μL。于37℃、5%CO2條件下培養18～24 h，小心吸凈96孔細胞培養板中的上清液，按Bright-GloTM熒光素酶檢測系統說明書加入細胞裂解液和熒光素酶底物，用化學發光酶標儀進行測定，使用Softmax軟件處理數據，計算結果[8]。

1.2.2 細胞病變抑制法

WISH細胞在完全培養液（含有10%胎牛血清的MEM培養基）中貼壁生長，按1∶4傳代，每周2～3次。取培養的細胞棄去培養液，用PBS洗2次后消化和收集細胞，用完全培養液配制成每1 mL含2.5×105～3.5×105個細胞的細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL。于37℃、5%CO2條件下培養4～6 h。取標準品，用測定培養液（含有7%胎牛血清的MEM培養基）稀釋至每1 mL約含1000 U，在96孔細胞培養板中做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。取供試品，用測定培養液稀釋成每1 mL約含1000 U，在96孔細胞培養板中做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。將配制完成的標準品溶液和供試品溶液移入接種WISH細胞的培養板中，每孔加入100 μL。于37℃、5%CO2條件下培養18～24 h，棄去細胞培養板中的上清液，將水泡性口炎病毒用攻毒培養液（含有3%胎牛血清的MEM培養基）稀釋至約100 CCID50，每孔加入100 μL。于37℃、5%CO2培養約24 h（鏡檢標準品溶液的50%病變點在1 U/mL時終止培養），棄去細胞培養板中的上清液，每孔加入染色液（取結晶紫50 mg，加無水乙醇20 mL溶解后，加水稀釋至100 mL）50 μL，室溫放置30 min后，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液（取無水乙醇50 mL、乙酸0.1 mL，加水稀釋至100 mL）100 μL，室溫放置3～5 min。混勻后，用酶標儀在570 nm波長處測定OD值，使用Softmax軟件處理數據，計算結果[8]。

1.3 考察指標

1.3.1 線性及測定范圍

按照“1.2.1”的方法進行測定，考察標準品及供試品劑量反應曲線的擬合方程、濃度范圍、相關系數、曲線平行性等指標。

1.3.2 專屬性

按照“1.2.1”的方法分別測定供試品、測定培養液、Y型聚乙二醇（摩爾濃度與供試品相同），考察HEK293puroISRE-Luc細胞對它們的反應性，評價方法的專屬性。

1.3.3 加標回收率

按照“1.2.1”的方法測定供試品加標回收率，標準品在加標供試品中的含量分別為25%、50%和75%，每一個加標供試品分別測定3次，計算平均值。加標回收率計算公式：（加標供試品測定值-供試品測定值）/加標量×100%。

1.3.4 精密度

1.3.4.1 重復性 按照“1.2.1”的方法，在同一次試驗內，對供試品進行10次測定，計算10次結果的變異系數，評價方法的重復性。

1.3.4.2 中間精密度 按照“1.2.1”的方法，在3個不同的試驗日期對供試品進行測定，每個試驗日期重復測定3次，取平均值作為該試驗日期的測定結果，計算3個測定結果的變異系數，評價不同日期測定結果的中間精密度。按照“1.2.1”的方法，在同一次試驗內，由3名實驗員對供試品進行測定，每名實驗員重復測定3次，取平均值作為該實驗員的測定結果，計算3個測定結果的變異系數，評價不同實驗員測定結果的中間精密度。按照“1.2.1”的方法，在同一次試驗內，使用不同代次的HEK293puroISRE-Luc細胞（分別為第5、20、35代）對供試品進行3次測定，每個代次的細胞重復測定3次，取平均值作為該代次細胞的測定結果，計算3個測定結果的變異系數，評價不同細胞代次測定結果的中間精密度[9-10]。

1.3.5 報告基因法與細胞病變抑制法測定結果比較

按照“1.2.1”及“1.2.2”的方法，分別測定供試品各10次，比較兩種方法測定結果有無差異。

1.4 統計學方法

實驗數據使用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用成組設計的兩樣本均數比較的t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 線性及測定范圍

標準品及供試品的劑量反應關系符合四參數方程：y=（A-D）/[1+（x/C）B]+D，相關系數均大于0.99，標準品及3個供試品四參數方程中B值非常接近，分別為1.01、0.95、1.03、1.07，說明標準品與供試品的劑量反應曲線具有較高的平行性。曲線上8個系列稀釋點的濃度范圍為0.15～2500 U/mL，曲線上直線段濃度范圍為3～150 U/mL。見圖1。

2.2 專屬性

使用報告基因法測定了聚乙二醇干擾素α2b標準品及供試品、測定培養液和Y型聚乙二醇，聚乙二醇干擾素α2b標準品及供試品出現了明顯的劑量反應曲線，而測定培養液和Y型聚乙二醇各個稀釋度均沒有化學發光信號，說明HEK293puroISRE-Luc細胞僅對聚乙二醇干擾素α2b中的干擾素部分具有反應性。見圖1。endprint

2.3 加標回收率

將標準品與供試品按不同的比例混合后測定其生物學活性，3批供試品的25%、50%和75%加標回收率平均值均在85%～115%之間。見表1。

2.4 精密度

方法精密度進行了重復性和中間精密度的驗證，重復性以10次測定結果的變異系數表示；中間精密度考察了日期、實驗員、細胞代次等變量對結果的影響，均以3次測定結果的變異系數表示。見表2。

2.5 兩種方法測定結果的比較

使用報告基因法及細胞病變抑制法分別測定3批供試品各10次，兩種方法的測定結果差異無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

報告基因法測定Ⅰ型干擾素活性原理是Ⅰ型干擾素與測活細胞細胞膜上的Ⅰ型干擾素受體結合后，通過信號轉導，激活干擾素刺激反應元件，啟動熒光素酶的表達，表達量與干擾素的生物學活性成正相關，加入細胞裂解液和熒光素酶底物后，測定其發光強度，以此測定Ⅰ型干擾素生物學活性[11]。干擾素經聚乙二醇修飾后，分子量顯著增大，構象、空間位阻、靜電結合性質、疏水性均發生改變，不可避免地影響其與受體的結合，從而影響生物學活性測定的結果[12]，因此在使用報告基因法測定聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學活性之前，必須進行方法學驗證[13]，驗證的結果應能證明該方法具有相當的準確性和可靠性，并應以能夠有效控制產品質量為基本標準，一般需要驗證線性、專屬性、準確性、精密度等指標。

分析方法的線性是指在給定的范圍內檢測結果與樣品中被分析物的濃度成比例關系的能力[14]。經驗證，該方法劑量反應關系符合四參數方程[15]，系列稀釋樣品的濃度范圍為0.15～2500 U/mL，對應的發光強度范圍為300～6000，空白對照發光強度只有10左右，方法信噪比較高，相關系數較高，標準品與供試品曲線平行性較好[16]。

專屬性是指可能存在某些組分（如雜質、降解物、基質等）時，對被分析物準確可靠測定的能力。由于聚乙二醇干擾素α2b注射液中可能含有殘留的Y型聚乙二醇，進行專屬性驗證時，除了考察測定培養液外，還考察了Y型聚乙二醇是否會對測定結果產生干擾，試驗結果表明HEK293puroISRE-Luc細胞對測定培養液及Y型聚乙二醇均沒有反應性。

評價方法的準確性，可以使用回收率試驗或者與成熟方法的測定結果進行比較[17]。經測定，三個供試品的25%、50%和75%加標回收率均在85%～115%之間。細胞病變抑制法是測定干擾素生物學活性的經典方法，也被用于聚乙二醇干擾素生物學活性測定[18]，通過比較，報告基因法與細胞病變抑制法測定結果無統計學差異，而且報告基因法的重復性明顯高于病毒抑制法。

方法的精密度包括重復性、中間精密度等評價指標，與理化測定方法相比，生物學測定方法的變異均較大，一般情況下，細胞試驗的變異系數應不超過30%[19]。該方法3個供試品的重復性為6.66%～7.70%，評價中間精密度時，選取了3個可能對試驗結果影響較大的變量進行考察：測定日期、實驗員和測活細胞代次[20]，它們的中間精密度分別為10.64%～11.01%、13.04%～15.12%和7.61%～8.54%，不同的實驗員由于操作熟練程度不同，測定結果的變異度較大，使用不同代次的細胞進行測定時，變異度較小，說明HEK 293puroISRE-Luc細胞的穩定性較高。

與細胞病變抑制法相比，報告基因法用于測定聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學活性，具有良好的專屬性、線性、準確性、精密度，并且具有操作簡便、耗時短、不使用病毒、無需在生物安全實驗室操作的特點，且兩種方法的測定結果無統計學差異，本方法可以用于聚乙二醇化Ⅰ型干擾素產品的質量控制。

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（收稿日期：2017-09-06 本文編輯：張瑜杰）endprint