血漿LL-37抗菌肽在支氣管哮喘患兒發病中的作用研究

郭彩云 張金鳳 魏楚洪 姚龍燕 孫艷娜

廣東醫科大學附屬婦女兒童醫院 廣東省佛山市順德區婦幼保健院兒科，廣東佛山 528300

支氣管哮喘是由包括肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞、T淋巴細胞在類的多種細胞參與的氣道慢性非特異性炎癥性疾病。慢性炎癥可以引發氣道高反應（airway hyper reactivity，AHR），表現出可逆性的氣流受限[1]。而除支氣管平滑肌痙攣外，管腔內的黏液栓塞、支氣管黏膜水腫、氣道的不可逆改變、纖毛運動障礙均可能導致氣流受限。近年來隨著對兒童哮喘研究的逐漸深入，多種細胞因子均被認為可能參與到哮喘的發病及發展[2]。抗菌肽是近年發現的天然免疫的肽類物質，廣泛分布于人體消化道、皮膚黏膜、呼吸道，在調節人體免疫或炎癥反應中發揮著重要作用，LL-37抗菌肽可能與白三烯（LTS）、白細胞介素8（IL-8）等多種細胞因子通過相互作用參與哮喘發病。還有報道[3]指出性肺間質纖維化患者存在肺泡基底膜II型上皮細胞再生現象，這與KL-6表達量上升促纖維原細胞增殖具有一定的聯系，雖然國內尚無明確的報道，但我們認為其與哮喘病的發生具有一定的聯系。因此本文探究血漿LL-37抗菌肽、Ⅱ型肺泡細胞表面抗原（krebs Von den Lungen-6，KL- 6）、白三烯（leukotrienes，LTS）在支氣管哮喘患兒發病中的作用研究，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月～2016年12月于我院診斷與治療的72例哮喘患兒、60例非喘息性肺炎患兒為研究對象，分別設為哮喘組、肺炎組，同時選取相同年齡的60例正常兒童，設為對照組。觀察組男34例，女38例；年齡最低5歲，最高13歲，平均（8.54±0.34）歲；肺炎組男28例，女32例；年齡最低5歲，最高13歲，平均（8.43±0.36）歲；對照組男28例，女32例；年齡最低5歲，最高12歲，平均（8.41±0.38）歲；本探究已獲得我院倫理委員會批準，患兒家屬知情并簽署知情同意書。納入標準：哮喘組符合中華醫學會兒科學分會呼吸學組《兒童支氣管哮喘防治指南（2015版）》[4]相關診斷標準；急性發作期；肺炎組符合中華醫學會全國感染病學術會議《社區獲得性肺炎診斷和治療指南》[5]；無明顯喘息癥狀；對照組為年齡、性別配對的健康體檢患兒；排除標準：合并先天性心臟病、畸形、心肺功能不全等；非急性發作期患兒；入組前使用糖皮質激素藥物及抗生素。三組患兒年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

所有患兒于上午7：00左右，空腹狀態，由同一專業護師進行靜脈血采集，共6mL，分為2mL的三等分，血液標本離心 10min（轉速：4000r/min），收集上層血清放于-80℃恒溫冰箱待檢。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測三組兒童血漿LL-37抗菌肽、KL-6水以及LTS水平，ELISA快速檢測試劑盒購自美國R&D公司，按試劑盒說明書進行檢測。取出待檢品恢復至室溫，將100μL標準品加到相應微孔，將100μL標準品稀釋液加至空白孔中，置于37℃恒溫箱進行溫育反應，共計60min；去除微孔中液體，并于每個微孔中注滿洗滌液，3min后甩干，反復洗滌3次，隨后利用吸水紙吸干微孔板；將100μL生物素抗體加入微孔中后混勻，置于37℃恒溫箱進行溫育反應，共計60min；再重復上述洗滌步驟；將100μL鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶加入微孔后混勻，置于37℃恒溫箱進行溫育反應，共計60min；再次洗滌后，將100μL底物液加入微孔，避免光照，放置于37℃恒溫箱，共計10～15min；再添加50μL終止液于微孔，混勻后反應終止，按說明書進行計算。采用PowerCube 肺功能儀（德國康訊）檢測患兒FVC、FEV1，并計算FEV1%。

1.3 觀察指標

ELISA檢測三組兒童血漿LL-37抗菌肽、KL-6水以及LTS水平；肺功能儀檢測患兒FVC、FEV1，并計算FEV1%。

1.4 統計學處理

采用統計學軟件SPSS18.0對數據進行統計分析，計量資料采用（x±s）表示,兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用方差分析,計數資料采用百分數（%）表示，采用χ2檢驗,相關性分析采用Pearson相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平比較

三組LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平差異具有統計學意義（P＜0.05），哮喘組血漿LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平高于肺炎組與對照組，肺炎組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 三組FVC、FEV1、FEV1%比較

三組FVC、FEV1、FEV1%差異具有統計學意義（P ＜ 0.05），哮喘組 FVC、FEV1、FEV1% 顯著低于肺炎組與對照組，肺炎組顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 三組LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平比較（x ± s）

表2 三組FVC、FEV1、FEV1比較（x ± s）

2.3 LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平與肺功能的相關性

血 漿 LL-37抗 菌 肽 與 FVC、FEV1、FEV1%呈負相關（P=0.000），血漿 KL-6與 FVC、FEV1、FEV1% 呈負相關（P=0.000），血漿 LTS與 FVC、FEV1、FEV1% 呈負相關（P=0.000），見表 3。

表3 LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平與肺功能的相關性

3 討論

近年來哮喘已成為全球性的公共衛生問題，加之環境污染的加劇，其發病率具有逐年上升趨勢，是兒童時期常見的呼吸系統慢性炎癥性疾病。當患兒接觸化學、物理、生物等刺激因素時容易發生廣泛的可逆性氣流受限，從而造成反復發作的咳嗽、氣促、喘息、胸悶等癥狀[6]。隨著醫學技術的進步，人們利用支氣管肺泡灌洗液、支氣管黏膜活檢、誘導痰等技術認為哮喘是由包括氣道結構細胞和細胞組分、炎性細胞等參與的氣道慢性炎癥性疾病。目前普遍認為哮喘的主要發病機制包括TH1/TH2類細胞因子失衡[7]。

如今眾多報道證實，部分炎性細胞通過在氣道的募集及活化作用參與哮喘的氣道慢性炎癥反應。研究認為嗜酸粒細胞通過釋放細胞因子等炎癥介質引起ATⅡ損傷，Ⅱ型肺泡細胞表面抗原（KL-6）來源于增殖、激發或受損的ATⅡ分泌， 并于ATⅡ頂端表達，能夠特異性判斷ATⅡ的功能[8]。目前KL-6已經以肺泡損傷直接相關的血清學指標的身份用于眾多呼吸系統疾病的早期診斷及預后判斷。但與支氣管哮喘的關系尚處于探討之中。陳紅梅等[9]小鼠實驗發現在哮喘小鼠模型的血清和肺泡灌洗液中KL-6水平顯著高于正常小鼠。本探究結果提示哮喘患兒血漿KL-6水平顯著高于肺炎組與對照組，這與之研究結果相符。白三烯（LTS）是花生四烯酸經在5－脂氧合酶作用下生成的脂類介質，能夠參與并加重氣道炎癥反應[10]。白三烯能夠促進支氣管收縮與氣道黏液分泌、使血管的通透性上升、對炎性細胞浸潤產生趨化作用、造成氣道重塑。Srakaew等[11]體內外實驗表明LTS對于成纖維細胞、吸道上皮細胞、血管內皮細胞、呼吸道平滑肌細胞等增殖具有促進作用。郝建成等[12]研究證實LTS能夠上調平滑肌細胞、氣道上皮細胞內皮素-1（endothelin-1，ET-1）mRNA的表達，促進ET-1釋放造成氣道收縮與重建。本探究結果提示哮喘組血漿LTS水平顯著高于肺炎組與對照組，肺炎組顯著高于對照組，證實LTS與哮喘及呼吸道疾病的緊密聯系，與之研究結果一致。LL-37抗菌肽具有明顯的趨化及調節免疫作用，在氣道炎癥反應過程中，能夠對中性粒細胞釋放白細胞介素8等細胞因子具有促進作用[13]；通過對肥大細胞、巨噬細胞的活化作用，增加TNF-α及組胺的生成[14]；王璐[15]報道稱LL-37還能作用于嗜酸性粒細胞對其生成白三烯、TNF-α、IL-8氣道促進作用，而已知上述細胞因子及白三烯都是哮喘發病、發展過程中的重要的炎性介質，由此我們認為LL-37可能從多方面參與了支氣管哮喘的發生。相關性分析顯示LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平均與肺功能呈明顯負相關關系，表明上述三種物質參與哮喘患兒肺功能的損傷。

綜上所述，哮喘患兒血漿LL-37抗菌肽、KL-6水以及LTS水平均顯著高于非喘息性肺炎患兒及正常兒童，與肺功能呈負相關，提示LL-37抗菌肽、KL-6、LTS與哮喘的發病及發展密切相關。

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