云貴川三省部分地區警犬狂犬病血清中和抗體調查

杜曉鵬，劉婷芳，徐 陶，王宇洋，毛愛國，許煒迪，張 垚，王 雄，黨西鋒，張明飛，馮 燁

（1. 公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204；2. 軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林長春 130122；3. 四川省公安廳警犬基地，四川成都 610041；4. 貴州省公安廳警犬基地，貴州貴陽 550000）

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（RABV）感染引起的一種致死性人獸共患病，病死率幾乎高達100%[1]。目前，對狂犬病尚無有效治療方法，及時接種疫苗是預防狂犬病最有效措施之一[2]。犬狂犬病免疫覆蓋率低于70%是誘發人間狂犬病發生的主要原因[3]。2016年全國共報告644例人狂犬病死亡病例。盡管狂犬病疫情整體呈下降趨勢，但貴州、四川、云南等省份仍是我國人和動物狂犬病高發地區[4]。

為了解我國警犬狂犬病免疫效果，分析影響警犬免疫合格率的因素，便于制定合適的警犬免疫程序，提高免疫合格率，于2017年對云南、貴州、四川三省部分地區警犬開展了狂犬病免疫血清中和抗體監測。

1 監測對象

1.1 范圍

選取云南省昆明市、貴州省貴陽市，以及四川省成都、綿陽、德陽、瀘州市等6個訓練場3月齡以上、臨床檢查健康的警犬進行抽樣調查，包括幼犬、訓練犬、種犬等。

1.2 背景

1.2.1免疫程序 6個地區的警犬免疫程序相同：3月齡時進行第1次狂犬病滅活疫苗注射；1歲以后，每年春季進行1次狂犬病滅活疫苗注射。幼犬在6月齡左右進行科目訓練，訓練3～6個月調至新工作單位后，其免疫程序并入新單位的年度免疫。

1.2.2疫苗種類 云南省、貴州省選用的是A品牌的犬、貓狂犬病滅活疫苗（Pasteur RIV株，至少2 IU），定義為A組；四川省選用的是B品牌的狂犬病滅活疫苗（HCP-SAD株，滅活前不少于106.3FAID50/mL），定義為B組。

1.2.3犬種 檢測的犬種包括德國牧羊犬、馬里努阿犬、昆明犬、羅威納犬、拉布拉多犬、史賓格犬與邊境牧羊犬。按照中國工作犬管理協會（CWDMA）的犬種分組表[5]，將檢測犬分為大型犬（身高55 cm以上）、中型犬（身高35.1～54.9 cm）與小型犬（身高35 cm以下）。其中，德國牧羊犬、馬里努阿犬、昆明犬與羅威納犬屬于大型犬，拉布拉多犬、史賓格犬與邊境牧羊犬屬于中型犬。此次監測沒有小型犬。

2 抽樣方法與數量

根據云南、貴州、四川三省的警犬工作布局情況，選取6個對周邊工作具有輻射性、警犬數量相對多的單位進行抽樣。先將每個抽樣單位的犬群以年齡為單位進行分類，即：3～6月齡、7～12月齡和1歲以上3個年齡段，再按下述方法進行抽樣：

3～6月齡，每窩犬、每個性別，按照10%的比例進行間隔抽樣；7～12月齡，每個單位、每個月齡段、每個性別，按照10%的比例進行間隔抽樣；1歲以上，每個單位以每12個月為選擇時間段，每個時間段、每個性別，按照10%的比例進行間隔抽樣。當每組的警犬總數不超過20只時，間隔抽樣可以進行；超過20只時，按照“隔2抽1”或“隔3抽1”原則抽樣，以此類推。

根據上述原則，在云南省昆明市某訓練場選取56只警犬，在貴州省貴陽市某訓練場選取60只警犬，在四川省成都市、綿陽市、德陽市、瀘州市4個訓練場選取71只警犬，共187只。

3 實驗室檢測

3.1 材料

3.1.1檢測試劑 標準血清：購自法國歐盟狂犬病血清學參考實驗室，效價為5.92 IU/mL；陰性血清：采集自未免疫健康犬，由軍事獸醫研究所的世界動物衛生組織（OIE）狂犬病參考實驗制備；FITC熒光素標記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體：購自Fujiribio公司；狂犬病病毒CVS-11細胞毒：軍事獸醫研究所保存，滴度為106.67TCID50/mL。

3.1.2待檢血清 從待檢犬前肢頭靜脈采血至少3 mL，靜置2 h，1 500 r/min離心30 min，分離血清，冷凍保存或冷鏈運送至實驗室，備用。如出現溶血，需重新采集血樣并分離血清。

3.2 方法

3.2.1樣本處理 將待檢血清56 ℃滅活30 min。

3.2.2檢測 采用OIE《陸生動物診斷測試和免疫手冊》（2013版）[6]中規定的直接免疫熒光病毒中和試驗（FAVN），對待檢血清進行RABV中和抗體效價檢測。首先對標準血清和待檢血清進行3倍梯度稀釋，稀釋區域第1列各孔內預先加入100μL培養液，每孔加入血清50 μL，混勻后吸取50μL加入第2列，依次稀釋。取預先確定滴度的狂犬病病毒CVS-11，以MEM培養液將其稀釋至30～300 TCID50/50 μL，除細胞及培養液對照孔外，每孔加入病毒稀釋液50 μL，置37 ℃中和1 h。BHK-21細胞經胰酶消化、分散、計數后，稀釋至4×105/mL，除培養液對照孔外，每孔加入50 μL細胞懸液，于37 ℃ 5% CO2培養箱培養2 d。棄細胞培養上清，加入50 μL冷丙酮，?20 ℃固定細胞1 h；PBST洗滌后，將RABV核蛋白熒光抗體稀釋至工作濃度，每孔加入50 μL工作液，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，熒光顯微鏡下觀察每個孔。孔內有熒光細胞即為感染，為陽性；無熒光細胞為完全中和，為陰性。利用基于Spearman-Karber推導的公式計算待檢血清的病毒中和效價。以犬免疫后的血清中和抗體效價≥0.50 IU/mL為陽性標準，達到或超過0.50 IU/mL即具有效保護水平。

3.2.3統計學分析 檢測數據采用SPSS18.0及Excel 2007進行分析處理。

4 結果與分析

4.1 總體情況

采集187只警犬血清進行RABV中和抗體效價檢測，發現抗體陽性127只，整體免疫合格率為67.91%（表1）。其中，四川省的警犬免疫合格率高于云南省，兩者之間差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義；貴州與云南、貴州與四川之間差異不顯著（P＞0.05），不具有統計學意義。

表1 187只警犬RABV中和抗體檢效價檢測結果

4.2 不同年齡警犬檢測

對187只警犬，按照年齡進行分類檢測發現，6歲以上警犬的抗體合格率最高，為87.10%，7～12月齡警犬最低，為41.67%。具體見表2。

4.3 不同免疫次數警犬檢測

對187只警犬，按照免疫次數進行分組檢測，發現免疫4次及以上的合格率最高，為86.79%，免疫1次的最低，僅為53.4%；免疫2次以上警犬的合格率明顯高于免疫1次的警犬（P＜0.01）。具體數據見表3。

表2 不同年齡的警犬RABV中和抗體效價檢測結果

表3 不同免疫次數警犬的RABV中和抗體效價檢測結果

4.4 不同疫苗免疫警犬檢測

在選用A品牌疫苗免疫的警犬中，檢出陽性73份，免疫合格率為62.93%；而選用B品牌疫苗免疫警犬的合格率為76.06%，差異顯著（P＜0.05）。具體見表4。

表4 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗體效價檢測結果

4.5 不同體型警犬檢測

對187只警犬，按照體型大小進行分類檢測發現，中型犬的免疫合格率為65.52%，大型犬為68.35%（表5），兩者之間差異不顯著（P＞0.05），說明警犬的體型大小對狂犬病免疫合格率影響不大。

表5 不同體型的警犬RABV中和抗體效價檢測結果

4.6 不同性別警犬檢測

對187只警犬，按性別進行分類檢測。結果顯示，公犬的免疫合格率為67.39%，母犬為68.42%（表6），兩者之間差異不顯著（P＞0.05），說明性別對狂犬病免疫合格率影響不大。

表6 不同性別的警犬RABV中和效價檢測結果

5 討論

本次檢測的警犬狂犬病總體免疫合格率為67.91%。世界動物衛生組織（OIE）研究表明，狂犬病抗體合格率大于70%，即可有效防控狂犬病傳播[7]。本次檢測發現警犬的免疫抗體合格率尚沒有達到該標準，表明部分警犬的狂犬病免疫效果并不理想。為尋找影響警犬狂犬病免疫效果的因素，本研究分析了不同年齡、不同免疫次數、不同疫苗類型，以及不同體型和性別的檢測結果。研究數據表明，警犬狂犬病免疫合格率與犬的年齡、免疫次數、疫苗類型等因素有一定的關系，而與體型和性別關系不大。

檢測發現1歲以下幼犬的免疫合格率為41.67～56.14%，而1歲以上警犬的免疫合格率均超過70%。這與Kennedy等[8]的研究結果相同。這是因為年齡較小的犬免疫系統不健全，接種疫苗的效果較差。本研究發現7～12月齡警犬的免疫合格率低于3～6月齡。這可能與其訓練時間和調動有關。據調查，警犬從6月齡開始進行訓練，3～6個月完成訓練科目后，被調往新的工作單位，參加新單位的年度狂犬病疫苗免疫。在此過程中便形成了免疫空檔期。因此，為了提高免疫合格率，除對6月齡以下的警犬增加免疫次數外，對于7～12月齡警犬，在離開原訓練場前或者調入新單位后應立即注射狂犬病疫苗，以消除免疫空檔期。

本研究結果顯示，警犬性別、體型對狂犬病免疫合格率影響不大。但有研究表明，中大型純種犬免疫效果不如小型犬或雜交犬[8-9]，因此可以通過增加免疫次數來提升中大型警犬的抗體水平。在本研究中，免疫2～3次、免疫4次及以上警犬的免疫合格率均明顯高于免疫1次的警犬，說明免疫合格率與免疫次數密切相關，免疫次數越多，合格率越高。

本次檢測發現，四川省采用的B疫苗免疫效果高于云南、貴州兩省的A疫苗，說明不同類型疫苗對警犬的免疫合格率也有影響。

以上檢測結果雖然反映出警犬的狂犬病免疫合格率與犬的年齡、免疫次數、疫苗類型等因素有關，且不受警犬性別和體型大小影響。但本次調查僅為橫斷面調查，如果對每一個影響因素進行連續性分析，結果是否與上述相同，就需后續研究證明。

6 結論與建議

本調查抽檢云南昆明市、貴州貴陽市，以及四川成都市、綿陽市、德陽市、瀘州市，共6個訓練場的187只警犬進行狂犬病免疫抗體檢測，發現總體免疫合格率為67.91%，未達到70%的國際標準。這主要是因為1歲以下幼犬的免疫合格率普遍較低，為41.67～56.14%。研究發現免疫次數越高，抗體合格率越高。另外，不同疫苗種類也對免疫效果有影響。

因此應加強對1歲以下幼犬的免疫，對6月齡以下警犬進行2次狂犬病滅活疫苗免疫，即3月齡時進行第1次基礎免疫，間隔28 d后進行第2次加強免疫；對7～12月齡警犬，在離開原訓練場前或進入新單位后，隨即進行1次狂犬病疫苗免疫，以消除免疫空檔期。對1歲以上警犬，應繼續執行每年1次的疫苗免疫程序，并提高血清中和抗體監測力度，對不合格警犬及時進行加強免疫。

[1] 俞永新. 狂犬病和狂犬病疫苗[M]. 2版. 北京：中國醫藥出版社，2001，127-142.

[2] 吳泰才，呂元聰，黃志雄，等. 推行犬用口服狂犬病疫苗是控制狂犬病的有效措施[J].廣西預防醫學，2003，9（2）：113-115.

[3] 姜輝，叢曉麗. 我國狂犬病流行現狀及檢測預防[J]. 生物技術進展，2011，1（1）：45-49.

[4] 殷文武. 我國狂犬病消除進展及展望[C]//中華預防醫學會，中國畜牧獸醫學會，中國工作犬管理協會. 2017年中國狂犬病年會論文集. 杭州：中華預防醫學會，中國畜牧獸醫學會，中國工作犬管理協會，2017：1-2.

[5] 中國工作犬管理協會. 中國工作犬管理協會犬組分組表（2007版）[EB/OL].（2008-08-04）[2017-12-15].http∶//www.cwdma.org/newsdisp.asp?id=7876.

[6] OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals（2013）[M]. Paris：OIE.，2013，267-272.

[7] 周宏鵬，劉擁軍，張秀娟，等. 全球狂犬病流行現狀及防治策略[J]. 中國動物檢疫，2015，32（1）：50-52.

[8] KENNEDY L J，LUNT M，BARNES A，et al. Factors influencing the antibody response of dogs vaccinated against rabies[J]. Vaccine，2007，25（51）：8500-8507.

[9] BERNDTSSON L T，NYMAN A K，RIVERA E，et al.Factors associated with the success of rabies vaccination of dogs in Sweden[J]. Acta veterinaria scandinavica，2011，53（22）：1-7.