北青龍衣抗腫瘤化學成分研究

周媛媛，郭爽，王瑩，劉雨新，付蕾，孫延平

(黑龍江中醫藥大學藥學院,教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室， 黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

北青龍衣是野生山核桃的未成熟果實青皮，主要產地有黑龍江東部，吉林、遼寧東部山區，內蒙古等地[1]。其味辛、苦，性平、澀，具有清熱、祛風、止痛等功效[2]。尤其在抗腫瘤方面(如肺癌、胃癌及肝癌等)有顯著作用，在民間得到廣泛應用[3]，為尋找抗腫瘤新藥提供了新的契機。本實驗在前期實驗的基礎上，利用95%乙醇回流提取結合多種色譜柱分離，成功分離了7個化合物，分別是熊果酸乙酯(1)，20(R)-24β-羥基-20，25-環氧-達瑪烷-3-酮(2)，1，7-二羥基-3，6-二甲氧基蒽醌(3)，反式鄰羥基肉桂酸(4)，4-羥甲基-2-甲氧基苯酚(5)，沒食子酸甲酯(6)，4-甲氧基-5-羥基-1-四氫萘酮(7)。

1 儀器與材料

Q-Tof(ESI)高分辨質譜儀(美國WATERS)； Bruker-400型超導核磁共振光譜儀(美國BRUKER)； AB-8型大孔吸附樹脂(南開大學化工廠)；Waters2414高效液相色譜儀(美國WATERS)；Atlantis Prep T3制備柱(19mm×250mm，10μm)；反相ODS(日本YMC);Sephadex LH-20(Pharmacia 公司)柱色譜;硅膠 (200～300目，青島海洋化工廠)；其它試劑均為分析純。

北青龍衣產地為黑龍江省牡丹江地區，經黑龍江中醫藥大學藥用植物學教研室蘇連杰教授鑒定為胡桃楸JuglandmandshuricaMaxim的未成熟外果皮。標本(20150815)保存于黑龍江中醫藥大學藥學院。

2 提取分離

青龍衣新鮮藥材，烘干后取5 kg粉粹，95%乙醇冷浸2 d后，加熱回流3次，合并濾液減壓得到浸膏415 g。用適量水混懸后，利用大孔樹脂色譜分段富集，先后用水、30%乙醇、50%乙醇及95%乙醇洗脫，其中95%乙醇洗脫部位42 g，反復硅膠柱層析(氯仿-甲醇100∶0→0∶100系統梯度洗脫)結合Sephadex LH-20純化后得到化合物1(8.1 mg)，化合物2(4.0 mg)，化合物3(5.7 mg)，化合物7(4.4 mg)；50%乙醇洗脫部位55 g，反復硅膠柱層析(氯仿-甲醇100∶0→0∶100系統梯度洗脫)結合ODS柱色譜、制備型HPLC分離得到化合物4(6.3 mg)，化合物5(3.5 mg)，化合物6(3.9 mg)。結構見圖1。

3 結構鑒定

化合物 1：白色針狀結晶(MeOH)，ESI-MS m/z：483 [ M-H ]-，推測分子量為484。1H-NMR(CDCl3，400MHz) δ：5.22(1H，s， H-12)，4.52(1H，t，J=7.6Hz，H-3)，2.05(3H，s，-OAc)，1.26(3H，s，H-23)，1.24(3H，s，H-24)，1.09(3H，s，H-26)，0.93(3H，s，H-27)，0.84(6H，d，J=7.2Hz，H-29，30)，0.73 (2H，m，H-11)，1.75(1H，t，J=10.6Hz，H-5)，1.72(3H，s，H-26)，1.63(3H，s，H-25)。13C-NMR(CDCl3，125MHz) δ：183.2 (C-28)，170.6(C-OAc)，137.8(C-13)，125.5(C-12)，79.2(C-3)，52.6(C-5)，52.5(C-18)，47.6(C-17)，47.2(C-9)，41.8(C-14)，39.4(C-8)，38.8(C-4)，38.7(C-19)，38.4(C-1,20)，37.4(C-10)，36.6(C-22)，33.3(C-7)，30.1(C-21)，28.1(C-2)，27.9(C-23)，27.8(C-15)，24.3(C-16)，23.2(C-11，27)，21.3(C-30)，20.6(C- OAc)，18.5(C-6)，17.2(C-29)，16.8(C-26)，15.5(C-25)，14.3(C-24)。分析以上波譜數據并與文獻[4]對照，鑒定化合物1為熊果酸乙酯。

化合物 2：白色針狀結晶(EtOAc)，ESI-MS m/z：457 [ M-H ]-，推測分子量為458。1H-NMR(CDCl3，400MHz) δ：1.32(3H，s，H-26)，1.18(3H，s，H-27)，1.15 (3H，s，H-21)，1.09(3H，s，H-28)，1.05(3H，s，H-29)，0.99(3H，s，H-18)，0.95(3H，s，H-28)，0.88(3H，s，H-30)，1.02～2.55(24H，m)。13C-NMR(CDCl3，125MHz) δ：217.9(C-3)，78.6(C-24)，75.6(C-20)，73.0(C-25)，55.1(C-5)，50.6(C-14)，49.6(C-17)，49.9(C-9)，47.5(C-4)，42.3(C-13)，40.4(C-8)，39.6(C-1)，37.0(C-22)，36.5(C-10)，34.3(C-7)，34.1(C-2)，31.2(C-15)，27.5(C-12)，26.5(C-28)，26.4(C-27)，25.5(C-16)，25.4(C-21)， 23.5(C-26)，22.7(C-23)，22.2(C-29)，22.1(C-11)，19.4(C-6)，16.4(C-30)，16.1(C-18)，15.4(C-19)。分析以上波譜數據并與文獻[5]對照，鑒定化合物2為20(R)-24β-羥基-20，25-環氧-達瑪烷-3-酮。

化合物 3：橙色針晶(MeOH)。ESI-MS m / z：299 [ M-H]-，推測分子量為300。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：7.56 (1H，s，H-5)，7.52 (1H，s，H-8)，7.15(1H，d，J=2.2Hz，H-4)，6.82(1H，d，J=2.2Hz，H-2)，3.95(3H，s，6-OMe)，3.92(3H，s，3-OMe)。13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ：186.7(C-9)，180.9(C-10)，166.2(C-3)，165.0(C-1)，153.5(C-6)，153.2(C-7)，135.5(C-4b)，127.0(C-4a)，126.8(C-8a)，112.5(C-8)，110.5(C-8b)，110.0(C-5)，107.9(C-4)，106.5(C-2)，56.7(6-OMe)，56.4(3-OMe)。分析以上波譜數據與并文獻[6]對照，鑒定化合物3為1，7-二羥基-3，6-二甲氧基蒽醌。

化合物 4：白色結晶(MeOH)。ESI-MS給出163 [M-1]-，分子量應為164。1H-NMR(CD3OD，400MHz) δ：8.03(1H，d，J=16.8 Hz，H-7)，7.52(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，7.23(1H，t，J=8.0Hz，H-4)，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.89(1H，dd，J=8.0 Hz，H-3)，6.60(1H，dd，J=16.8Hz，H-8)。13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ：172.0(-COOH)，158.6(C-2)，142.7(C-7)，132.8(C-4)，129.8(C-6)，123.5(C-1)，121.2(C-5)，119.6(C-8)，117.8(C-3)。分析以上波譜數據并與文獻[7]對照，鑒定化合物4為反式鄰羥基肉桂酸。

圖1 化合物1～7結構

化合物5：淡黃色結晶(MeOH)。EI-MS m / z：154 [ M ]+，推測分子量為154。1H-NMR(CD3OD，400MHz) δ：7.56(1H，d，J=2.2 Hz，H-3)，7.50(1H，dd，J=8.8，2.2 Hz，H-5)，6.77(1H，d，J=8.8 Hz，H-6)，3.86(3H，s，-OCH3)，3.30(2H，s，-CH2OH)。13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ：150.4(C-2)，148.4(C-1)，130.1(C-4)，124.0(C-5)，115.9(C-6)，114.7(C-3)，63.0(4-CH2OH)，56.7(2-OCH3)。分析以上波譜數據并與文獻[8]對照，鑒定化合物5為4-羥甲基-2-甲氧基苯酚。

化合物 6：淺黃色粉末(甲醇)，EI-MS(m/z)：184[M]+，表明相對分子量為184。1H-NMR(CD3OD，400MHz) δ：7.05(2H，s，H-2，6)，3.88(3H，s，COOCH3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ：170.3(COOCH3)，145.8( C-3，5)，140.12(C-4)，122.4(C-1)，109.9(C-6)，109.8(C-2)，54.5(COOCH3)。分析以上波譜數據并與文獻[9]對照，鑒定該化合物6為沒食子酸甲酯。

化合物 7：白色無定形粉末(CHCl3)，EI-MS(m/z)：192[M]+，表明其分子量為192。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：8.56(1H，s，5-OH)，7.55 (1H，brd，J=8.2Hz，H-7)，7.36(1H，t，J=8.0Hz，H-8)，7.09(1H，brd，J=8.2Hz，H-6)，5.01(1H，m，H-4)，3.59(3H，s，4-OCH3)，2.84(1H，m，H-2a)，2.65(1H，m，H-2b)，2.29 (1H，m，H-3a)，2.14(1H，m，3b)；13C-NMR(125MHz，CDCl3) δ：196.1(C-1)，156.1(C-5)，132.6(C-9)；129.5(C-7)，126.6(C-10)，122.2(C-6)，119.3(C-8)，80.3(C-4)，55.5 (C-11)，35.8(C-2)，27.6(C-3)。分析以上波譜數據并與文獻[10]對照，鑒定故化合物7為4-甲氧基-5-羥基-1-四氫萘酮。

4 討論

化合物1～4是首次從北青龍衣中分離獲得，分別屬于蒽醌類和三萜類。目前已有文獻報道[11-15]，上述類型化合物均具有良好的腫瘤細胞抑制作用，為進一步研究青龍衣中抗腫瘤作用機理提供了藥效物質基礎。值得注意的是，這些成分是否對青龍衣中主要成分胡桃醌具有增效減毒的協同抑制作用還需要進一步開展相關研究。

[1] 高樹贏.北青龍衣的化學成分及質量標準的研究[D].哈爾濱：黑龍江大學，2009.

[2] 董文婷，霍金海，張海燕，等.干、鮮北青龍衣中胡桃醌的含量及抗腫瘤活性比較[J].吉林中醫藥，2016，36(4):401-404.

[3] 姬艷菊，徐巍.青龍衣提取物對人肝癌細胞株抑制作用的實驗研究[J].中醫藥學報，2014，42(5):30-34.

[4] 王金蘭，姚佳，劉繼梅，等.柞樹皮化學成分研究[J].中草藥，2014，45(21):3062-3066.

[5] 劉繼梅，張中偉，姚佳，等.臭椿樹枝化學成分研究[J].林產化學與工業，2013，33(4):121-127.

[6] 張濤.扯根菜和唐菖蒲的化學成分研究[D].成都：中國科學院成都有機化學研究所，2007.

[7] 楊琳，趙慶春，譚菁菁，等.桂枝的化學成分研究[J].實用藥物與臨床，2010，13(3):183-185.

[8] 李大馨.東京楓楊化學成分及其抗腫瘤活性研究[D].天津：天津大學，2007.

[9] 崔瑩.盤龍七化學成分研究Ⅱ[J].中草藥，2012，43(9):1075-1077.

[10] Machida K, Matsuoka E, Kasahara T, et al. Studies on the constituents of Juglans species. I. Structural determination of(4S)-and(4R)-4-hydroxy-α-tetralone derivatives from the fruit of Juglans mandshurica Maxim. var. sieboldiana Makino [J].Chem Pharm Bull, 2005, 53(8): 934-937.

[11] 季麗.兩種大環抗腫瘤化合物的結構修飾及其活性研究[D].青島：中國海洋大學，2004.

[12] 韓崇,朱雄,徐云根.蒽環類抗腫瘤化合物的研究進展[J].中國新藥雜志，2013，22(3):307-312.

[13] 張珍珍,趙氚,陳思,等,齊墩果烷三萜類化合物的抗腫瘤活性及機制研究進展[J].藥學進展，2011,35(8):353-359.

[14] 宋長城,朱美玲.中藥所含三萜類化合物抗腫瘤活性及其作用機制的研究進展[J].現代腫瘤醫學，2011,19(9):1880-1883.

[15] 李嬌妹,鄭紡,翟麗娟,等.三萜類化合物抗腫瘤活性研究進展[J].中草藥，2014,45(15):2265-2271.