應用SNP精準鑒定大豆種質及構建可掃描身份證

魏中艷 李慧慧 李 駿 Yasir A. Gamar 馬巖松 邱麗娟,*

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應用SNP精準鑒定大豆種質及構建可掃描身份證

魏中艷1李慧慧1李 駿2Yasir A. Gamar1馬巖松3邱麗娟1,*

1國家農作物基因資源與遺傳改良重大科學工程/ 農業部種質資源利用重點實驗室/ 中國農業科學院作物科學研究所, 北京100081;2廣西大學農學院, 廣西南寧 530004;3黑龍江省農業科學院大豆研究所, 黑龍江哈爾濱 150086

為加強大豆種質資源管理及品種保護, 本研究構建了一套基于單核苷酸多態性(SNP)標記的快速鑒定體系。選用分布于13個基因的23個SNP標記對599份大豆表型精準鑒定種質進行基因型分析。結果表明, SNP標記的遺傳多樣性指數范圍0~0.722, 其中3個SNP在供試材料中不存在堿基差異, 2個SNP為特異等位變異。從具有多態性的20個SNP中選出14個(GlySNP14)用于種質鑒定, 其中12個為高多態性SNP, 2個為特異性SNP。模擬結果表明, GlySNP14的種質鑒別能力(750份種質)高于任意相同數目標記構成的SNP隨機組合(最多361份種質)。GlySNP14在599份種質中共形成了176個單倍型, 其中100份種質具有獨特的單倍型。結合這些種質的其他屬性, 構建了100份種質由38個數字組成的身份證, 前10位數字為種質屬性信息碼, 包括品種類別、來源地等; 11~38位數字為品種分子指紋碼, 代表品種的特異分子信息, 并最終以一維碼和二維碼的形式表示, 為種質資源簡易管理與保護利用提供了有效途徑。

大豆; SNP; 遺傳多樣性; DNA指紋圖譜; 品種ID

大豆(L.)是豆科(Fabaceae)大豆屬(Glycine)一年生草本作物。大豆起源于中國已得到國際學者普遍認可[1-2], 我國大豆種質資源豐富, 保存的數量居全世界之首[3]。大豆也是我國重要的經濟作物之一, 在全國都有廣泛種植[4], 到目前為止, 已育成和推廣大豆品種超過1800個[5]。隨著大豆種質資源和品種的交換, 種子市場中“同物異名”和“套牌”、“冒牌”現象日趨嚴重, 這不僅給市場管理和消費者帶來困擾, 更會給品種的選育、經營及種植等相關人員和單位帶來經濟損失。因此, 種質資源和品種身份證的構建具有重要意義。

作物品種資源種子身份證的構建已從形態標記向高通量分子鑒定技術發展。傳統的鑒定方法主要是形態標記、生理標記和生化指標, 隨著品種資源數目的增加, 僅僅基于這些特性已經難以對現有品種準確鑒定[6]。因此急需開發一套準確可靠、簡單易行的快速鑒定體系, 為作物新品種審定及種質材料評價提供科學依據。20世紀以來, DNA分析技術開始被大量應用于植物學研究, 開發出RFLP、RAPD、AFLP、SSR以及SNP、SRAP等一系列標記[7]。分子標記不但能夠節省常規田間調查和收集整理數據的時間, 而且具有不受環境影響、鑒別品種準確和變異極豐富等優點[8], 利用分子標記構建DNA指紋圖譜進行品種真偽性已成為發展趨勢。鑒于方法的穩定和有效性, 國際植物品種權保護聯盟(UPOV)在BMT測試指南草案中已將構建DNA指紋數據庫的標記方法確定為SSR和SNP[9]。較SSR標記相比, SNP具有針對性強、變異來源豐富、潛在數量巨大等特點。Jung等[10]首次在辣椒中分析438對COSII引物, 選出40個可以鑒別79個熱帶商業品種和17個甜椒品種的SNP標記。Shirasawa 等[11]研究發現, 利用8個SNP標記可以區分43個水稻品種。王大莉[12]用72個SNP標記構建了22個香菇主栽品種的DNA指紋圖譜。利用SNP分子標記鑒定作物的指紋圖譜, 對作物品種資源管理與品種保護利用及評價無疑將起到積極的作用。

迄今為止, 受制于SNP標記自動化篩選及檢測成本高等問題, SNP標記在大豆種質資源的鑒定方面鮮有報道, 利用與表型性狀相關的功能性SNP鑒定資源, 且最終以條形碼的形式表現的研究更未見報道。本研究利用與主要農藝性狀密切相關的功能基因SNP標記, 精準鑒定不同生態區的大豆種質, 分析其DNA指紋圖譜, 同時結合大豆品種屬性, 構建其分子身份證, 以期為大豆遺傳研究、分子輔助育種和品種鑒定提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

北方種質208份, 于2008年至2010年連續3年種植于北方地區3個不同的地點(黑龍江、吉林、內蒙古); 黃淮種質245份, 于2008年至2010年連續3年種植于黃淮地區3個不同的地點(山東、河南、河北); 南方種質146份, 于2008年至2010年連續3年種植于南方地區3個不同的地點(湖北、江西、廣西)(圖1)。并對其茸毛色、結莢習性、百粒重、熟期、胞囊線蟲抗性等表型進行多年多點鑒定。

1.2 DNA提取和純化

萌發后取每份大豆種質5個單株的幼葉混樣, 使用Fermentas試劑盒提取基因組DNA。其后加2 μL稀釋20倍的RNase A, 放到37°C培養箱中15 min, 去除DNA中的RNA, 于–80°C保存待送樣。

圖1 大豆精準鑒定種質的種植分布圖

1.3 SNP標記鑒定

選用的23個SNP位點中, 3個來自大豆結莢習性相關基因; 2個來自大豆茸毛色相關基因; 7個來自大豆熟期相關基因,,和; 4個來自大豆SCN抗性相關基因和; 6個來自大豆SMV抗性相關基因、、和; 1個來自大豆百粒重相關基因(表1)。采用Infmium芯片技術(Bioyong Technologies Inc.), 鑒定全基因組或特定SNP位點。

1.4 SNP多樣性計算

利用PowerMaker 3.25軟件[13]計算SNP標記在精準鑒定種質中的分布頻率及遺傳相似系數; 參照Poole[14]介紹的Shannon-Weaver公式, 多樣性指數= –∑PlnP, 式中P為每個位點的等位變異頻率。

1.5 SNP鑒別能力模擬

利用14個SNP在599份大豆種質中的等位變異頻率, 通過R程序模擬分析(http://www.r-project. org/)。共設置8個模擬群體, 群體大小分別為50、100、500、1000、1500、2000、2200和2500。在20個SNP中(除去3個沒有堿基差異的標記: TT14, PRO16, SER46)隨機選取14個SNP對上述8個群體進行鑒別分析, 該過程一共模擬1000次。最后利用每個群體1000次模擬結果的平均值比較分析。

1.6 數據統計分析

利用Flapjack軟件[15]分析單倍型; 利用MEGA5.1軟件對供試大豆品種進行聚類分析, 并確定材料的遺傳結構; 利用條碼在線生成器(http:// barcode.tec-it.com/barcode-generator.aspx)對品種身份證進行條碼轉換。

2 結果與分析

2.1 SNP標記多樣性分析

本研究23個SNP標記共來自于13個基因, 分別與結莢習性、茸毛色、熟期、百粒重、大豆胞囊線蟲病與花葉病毒病抗性相關(表1), 用這些標記分析599份種質, 每個SNP標記其遺傳多樣性指數變異范圍為0~0.722, 平均值為0.312。在23個SNP標記中, 9個發生顛換, 變異范圍為0.50%~36.93%; 5個發生缺失, 變異范圍為0.67%~99.16%; 6個為轉換, 變異范圍為0.17%~43.79%。絕大多數位點都有2~3種基因型, 只有3個位點僅有一種基因型, 分別是TT14、PRO16和SER46。

利用599份種質的23個SNP鑒定數據分析表明, 精準鑒定種質間的平均遺傳相似性系數為0.7923, 以“中豆24”與“茶色豆”遺傳差異最大, 為0.0435, 而“Magnolid”與“Nova”遺傳差異最小, 為0.9783。根據中國大豆3個生態區劃分(表2), 北方生態區(吉林、黑龍江和內蒙古3個省、區) 208個品種間的平均遺傳相似系數為0.8295; 黃淮海生態區(包括山東、河南與河北3個省) 245個品種間的平均遺傳相似系數為0.7941; 南方生態區(包括湖北、江西和廣西3個省、區) 146個品種間的平均遺傳相似系數為0.7982。表明品種間遺傳差異以北方生態區最小, 南方生態區次之, 黃淮海生態區最大。

2.2 GlySNP14的構建

通過對23個SNP位點的等位變異分析, 發現兩類特殊的SNP, 一類是2個具有特異等位變異的SNP位點(TT12和AT22), 僅用該位點即可區分“半野生”和“黃豆<2>”, 也可將這2份種質與其他種質區分開來。另一類是3個沒有堿基差異的SNP位點, 包括TT14、PRO16和SER46, 這3個位點不能區分任何一種參試的種質, 不適宜用于身份證構建(表1)。具有多態性的20個SNP對599份種質進行單倍型分析, 共形成225個單倍型(圖2-A), 其中142個為特異單倍型(圖2B), 即20個SNP可以將這142份種質完全區分。

在去除上述兩類特殊等位變異的基礎上, 進一步對18個多態性SNP進行組合分析, 采用隨機組合和按SNP多樣性指數由高到低逐一組合兩種方法, 選出鑒別品種能力最佳標記組合GlySNP14。如圖3所示, 選用多樣性指數高的SNP組合的鑒別種質效率明顯優于隨機組合, 選用多樣性指數最高的2個SNP標記PRO19和SER43進行組合, 可以鑒別出1份種質, 平均每個標記鑒別0.5份種質, 而隨機選用AR2和AR5進行組合, 不能鑒別出任何種質; 在上述基礎上, 增加TT8與PRO19和SER43進行組合, 可以鑒別出3份種質, 平均每個SNP鑒別效率為0.5,而利用隨機選取的AR7與AR2和AR5進行組合, 僅能鑒別出1份種質, 平均每個SNP鑒別效率為0.33。當多樣性指數高的前12個SNP標記(AR2、AR5、AR7、TT8、TT11、PRO19、AT21、AT23和SER32、36、43、64)進行組合時, 可以鑒別98份大豆種質, 每個SNP的平均鑒別效率最高, 達到8.17, 即該12個SNP標記為最佳組合。利用上述12個SNP標記與具有特異等位變異的2個SNP標記(TT12和AT22)相結合組成GlySNP14, 在599份大豆種質中共形成176個單倍型, 其中100個為特異單倍型。即利用GlySNP14可以將100份大豆種質完全區分, 同時也可以將該100份大豆種質從其他種質種中區分出來。

表1 SNP標記多樣性分析

1TV: 顛換;2TS: 轉換;3D: 缺失;4ND: 數據缺失。

1TV: transversion;2TS: transition;3D: deletion;4ND: no data recorded.

表2 大豆3個主要生態區種質資源的遺傳相似性

圖2 基于SNP標記的單倍型分析

A: 599份大豆品種的單倍型分析; B: 特異單倍型分析。

A: Analysis of haplotype for 599 soybean varieties; B: Analysis of specific haplotype.

圖3 SNP標記組合分析

2.3 GlySNP14的聚類分析

GlySNP14可以將100份大豆種質完全區分開(圖4), 共分為8組, A與F組分別以地方和選育品種為主, 各占56.25%和76.02%; B組的3個品種分別是1個美國春大豆和2個地方品種; C、G和H組均由國外和選育品種組成; E組10個品種中3個為美國春大豆, 7個為黃淮夏大豆; 最后D組為混合組, 20個品種中40%為東北春大豆, 國外品種和南方春大豆各占30%。

2.4 GlySNP14鑒別能力的模擬分析

SNP大多只有兩種堿基形式, 被視為二等位標記[12]。雖然14個SNP理論上有214種組合方式, 但在現實種質或群體材料中形成的組合方式要比理論上低很多。利用每個SNP在599份種質中形成的等位變異頻率, 對選出的14個SNP的品種鑒別能力的模擬分析表明, 這14個SNP最多可鑒別750個不同種質。為了驗證GlySNP14的鑒別效率, 從20個SNP中(除去3個沒有堿基差異的標記TT14、PRO16和SER46)隨機選出14個SNP進行鑒別能力模擬分析, 該過程模擬1000次。結果如圖5所示, 隨機選擇的任意14個SNP組合, 最多只能鑒別361個品種。在8個不同大小的模擬群體中, GlySNP14的鑒別能力均強于隨機選擇的SNP標記。

2.5 SNP指紋圖譜構建

為構建身份證, 對大豆種質的SNP數據進行數字化編碼。在14個SNP標記中共有10種基因型, 分別為AA、GG、CC、TT、DELDEL、TA、CT、CG、GA和C.DEL, 用數字1~5對堿基A、G、C、T和DEL編碼。例如, 地方品種“茶色豆”的14個SNP標記基因型分別為GG、AA、AA、CC、TT、GG、TT、CC、TT、GG、CC、GG、TT和AA, 轉換成28位的指紋編碼為2211113344224433442233224411, 其中第1~4位的“2211”表示前2個SNP位點AR2和AR5基因型為GG和AA, 第5~8位的“1133”表示位列第3、第4位的SNP位點基因型為AA與CC, 其余20位的編碼以此類推。

圖4 基于SNP標記的100份大豆品種聚類分析圖

圖5 隨機選擇的14個SNP與GlySNP鑒別能力的模擬分析

2.6 大豆種質商品碼構建

除SNP指紋編碼外, 進一步對大豆品種的商品信息編碼。基本商品信息分為3個部分: (1)作物及品種屬性代碼。利用7位數字標識作物及品種屬性, 其中1~6位表示大豆種屬(大豆屬于大田作物中的豆科作物); 第7位表示大豆栽培、野生類型, 即“1”表示栽培大豆, “2”表示野生大豆。(2)區域代碼。用于表示大豆品種的來源地區, 以各省市的行政區劃代碼組成, 即河北為13、山東為37、黑龍江為23等, 國外品種以00表示。(3)品種類別代碼。用“1、2”表示大豆的地方與選育兩種類型。例如, 大豆品種“青仁黑豆”的商品碼為“0102011221”, 其中前7位“0102011”為作物及品種屬性代碼, 其中第1、第2位的“01”表示大田作物; 第3、第4位的“02”表示豆科; 第5、第6位的“01”表示大豆; 第7位的“1”表示栽培豆。第8、第9位的“22”是行政區劃代碼, 表示該品種來源地為吉林省。第10位“1”表示該品種為地方品種。

2.7 大豆種質身份證構建

大豆種質身份證由上述的商品碼與指紋碼構成, 總數為38位。以“北豐14”為例, 其身份證號為01020112322211115541223444111133224141, 其作物屬性為大田作物-豆科-大豆-栽培種(01-02-01-1); 品種來源為黑龍江選育品種(23-2); 品種DNA指紋為2211115541223444111133224141, 表示其14個SNP分子標記基因型分別為GG、AA、AA、DELDEL、TA、GG、CT、TT、AA、AA、CC、GG、TA和TA。依據此方法完成了其他大豆種質身份證的構建。利用條碼在線生成軟件分別生成大豆品種身份證的一維碼與二維碼。

圖6 “北豐14”品種身份證及條形碼示意圖

A: “北豐14”品種身份證構成; B: “北豐14”品種身份證條形碼。

A: Composition of “Beifeng 14” variety ID; B: Bar code of “Beifeng 14” variety ID.

利用條碼在線生成軟件分別生成100份大豆品種身份證的一維碼與二維碼。“北豐14”的身份證條碼如圖6-B, 其余99份品種的部分身份證條碼見表3。將本研究中大豆品種身份證以一維碼或二維碼的形式來標示相應的種子, 就可以對種子的相關信息快速識別和規范管理, 也對相應品種的知識產權提供了保護和科學依據。

3 討論

3.1 品種DNA指紋圖譜的不同表現形式

利用分子標記構建DNA指紋圖譜, 已逐漸向快速高效監測方向發展, 并趨向于數字化。趙洪錕等[16]構建吉林大豆骨干親本及主推品種RAPD標記指紋圖譜, 采用的是分子標記在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率大小及條帶的有無。隨后, 從定性描述轉為二位碼, 將分子標記條帶的有無轉化為“0”和“1”編碼成數字指紋[17]。但上述二位碼大多屬于單純的遺傳變異編碼, 并未與品種信息相結合。陸徐忠等[18]利用SSR標記鑒定水稻品種, 并將SSR標記信息與商品信息相結合構建了供試水稻品種身份證, 并最終以條形碼的形式表現。該方法構建的品種身份證表示形式簡便, 易于監測。但前人所使用的SSR標記多為隨機標記, 無法與表型性狀相聯系。相比之下, SNP具有針對性強, 變異來源豐富, 且潛在數量巨大等特點。然而, 利用SNP標記, 尤其是像本研究利用功能標記構建作物身份證, 并最終以條形碼的形式表現的研究尚未見報道。

表3 部分大豆品種的身份證條碼信息

本研究構建的大豆種質資源身份證, 不同于遺傳上單純的分子指紋圖譜。該身份證由38個數字組成, 包括品種屬性碼和分子指紋碼, 其中品種屬性碼由作物屬性、品種來源、品種類別3個部分組成, 最終將品種身份證編碼轉換為條碼形式(一維碼和二維碼)。利用該方法構建的大豆品種身份證可以應用在多種途徑上, 例如市場上商品種子的管理, 將品種身份證條形碼或二維碼標識于種子包裝上, 可以方便種子信息的獲得與防偽。同時本試驗構建身份證用的分子標記是主要農藝性狀功能基因SNP標記, 包括結莢習性、茸毛色、熟期、百粒重、胞囊線蟲病與花葉病毒病抗性。上述農藝性狀均與大豆品質和農業生產及農民利益息息相關, 有望用于進一步豐富品種分子身份證信息。

3.2 SNP標記與SSR標記指紋圖譜的比較

指紋圖譜構建所用標記的選擇向快速、成本低和高通量檢測方向發展。國際植物品種權保護聯盟(UPOV)確定構建DNA指紋數據庫的標記包括SSR和SNP[9]。SSR具有多態性高的優點, 但相比之下, SNP標記在基因組中更為豐富。Jones等[19]同時利用88個SSR標記和187個SNP標記對58個玉米自交系和2個雜交種進行基因型鑒定分析表明, SSR標記的平均等位變異數目是SNP標記的2.5倍, 但平均雜合率比SNP高0.5倍; 相比之下, SNP的可重復性(98.7%)顯著高于SSR標記(91.7%)。張昆鵬等[20]比較9個油菜品種的SSR指紋圖譜和SNP指紋圖譜發現, 基于SNP標記計算的遺傳系數更精確, 結果更可靠。這表明SNP標記的高重復性和準確性能夠保證不同條件下檢測結果的正確性和可比性, 這對于種質和品種的鑒定、品種權的保護與管理都是非常重要的技術支撐。

大豆身份證構建的相關研究中, SSR標記是鑒別品種的常用方法。但相比之下, SNP在大豆中分布更為廣泛。到目前為止, SNP在栽培大豆中的總數達到4~5×106個[21], 野生大豆PAN-GENOME中存在3.63~4.72×106個[23], 幾乎每1 kbp就可發現4個SNP。雖然與SSR相比, SNP等位變異類型有限, 但這一不足可以通過提高SNP數量來克服; 由于SNP大多只有兩種堿基形式, 被視為二等位標記, 具有簡化基因分型方法及后續數字編碼的優勢。與SSR標記比, SNP是核苷酸自身變異, 不需要讀取分子量大小, 采用測序方法直接獲得等位變異基因型, 遺傳穩定性高, 更適合于數字化建庫。

最少SNP標記的選擇是降低構建指紋圖譜成本的核心。與SSR的等位基因數多相比, SNP需要的數量比較多。Yoon等[6]比較了23個SNP核心標記與Song等[22]開發的13個SSR標記鑒定大豆種質的效率, 結果表明, 平均每個SSR位點的等位變異數為7.80, 平均多樣性為0.73, 可以將101個品種完全鑒別; 每個SNP位點的平均等位變異數為2, 平均多樣性為0.45, 可鑒別132份供試品種; 而對23個SNP位點鑒別能力模擬分析結果表明, 最多能鑒別2200份種質。相比之下, 本研究選用的14個標記模擬分析中最多可以鑒別750份種質, 但GlySNP14標記組合在實際的599份大豆種質中鑒別出100份種質。這可能是由于選用的標記為重要性狀相關標記, 有些標記為功能基因標記, 多態性相對較低有關, 但這些標記在鑒別品種的同時, 具有提供基因型數據的優點。這為今后作物種質SNP 指紋圖譜庫的構建提供了有益的啟示。

4 結論

從23個功能基因相關SNP中挑選出14個, 精準鑒定了大豆種質品種。GlySNP14在599份大豆品種中鑒定出100份種質并對其構建了品種身份證, 該身份證由品種的屬性信息與分子指紋信息兩部分組成, 并最終以條碼形式(一維碼和二維碼)表示, 為大豆種質資源管理與保護利用提供了便利。

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Accurate Identification of Varieties by Nucleotide Polymorphisms and Establishment of Scannable Variety IDs for Soybean Germplasm

WEI Zhong-Yan1, LI Hui-Hui1, LI Jun2, Yasir A. Gamar1, MA Yan-Song3, and QIU Li-Juan1, *

1National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI) / Key Laboratory of Germplasm Utilization, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2College of Agriculture, Guangxi University, Nanjing 530004, Guangxi China;3Soybean Research Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China

In order to strengthen the management of soybean germplasm and variety protection, SNP markers were developed to establish the identity of soybean varieties. A set of 23 SNP markers distributed in 13 genes were used to discriminate genotypes of 599 soybean varieties, grown in most of the soybean producing areas in China. Fourteen SNPs with high polymorphism selected from the 23 SNPs (GlySNP14) showed the improved variety identification capability, compared with any combination of 14 random SNPs. A simulated experiment confirmed that GlySNP14 could effectively distinguish of 750 soybean varieties, while the combination of random by selected from the 14 SNPs could distinguish only 361 varieties. The established ID of soybean varieties in this study contained a 38-digit serial code, which can be used for the accurate identification of soybean varieties and meet the requirements of genetic resources protection.

soybean; SNP; genetic diversity; DNA fingerprint; variety ID

2017-06-11;

2017-11-21;

2017-12-11.

10.3724/SP.J.1006.2018.000315

本研究由農產品質量安全監管(種子管理)項目(2130109)和國家農作物資源共享平臺(NICGR2016大豆)項目資助。

This study was supported by the project of Quality and Safety Supervision of agriculture food (Seed Management) (2130109) and National Infrastructure for Crop Germplasm Resources (NICGR2016 Soybean).

Corresponding author邱麗娟, E-mail: qiulijuan@caas.cn, Tel: 86-10-82105843, Fax: 86-10-82105843

E-mail: w_zhongyan@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20171208.0936.002.html