新型雙功能席夫堿熒光探針分別識別檢測Zn2+和CN-

董振明 王佳娜 張 強 王 煜

(山西大學化學化工學院， 太原 030000)

1 引 言

生物樣品及環境中陰陽離子的識別與檢測是目前化學領域的研究熱點。在眾多檢測方法中，熒光傳感器由于具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單和可實時在線檢測等優點而備受關注[1]。 Zn是人體中含量僅次于鐵的過渡金屬，是人體必需的微量元素之一。在基因表達、神經信號傳輸、金屬酶的調節、DNA結合或識別等多種生物學活動中發揮著重要作用。Zn2+代謝失衡會導致缺氧缺血、癲癇及各種神經系統疾病，如老年癡呆癥、帕金森病等。此外，過量的Zn2+會使土壤微生物的活性降低，對植物造成不良影響。因此，對環境及生物系統中Zn2+的檢測具有十分重要的意義[2]。目前文獻報道的Zn2+熒光傳感器很多[3～12]，但仍然存在合成復雜、選擇性和靈敏度不理想等不足。Hagimori等[4]合成了可在水相體系中檢測Zn2+的熒光探針，但不能消除Cd2+對檢測的干擾，選擇性有待提高。Lee等[8]設計的席夫堿探針合成方法較簡單，但只能在純乙腈中檢測Zn2+，且靈敏度不高。因此，開發合成方法簡單、選擇性好、靈敏度高的Zn2+傳感器，具有重要的實際應用價值。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV-2450分光光度計(日本島津公司); LS-55熒光光度計(美國Perkin-Elmer公司)，激發波長分別為328 nm (Zn2+)和335 nm (CN-); PicoMaster 1000-TCSPC 熒光分光光度計(美國PTI公司); 雷磁pHS-3C 酸度計(上海精密儀器公司); DRX-600核磁共振儀(瑞士F?llenden公司); TENSOR Ⅱ紅外光譜儀(德國Bruker公司); Thermo Scientific Q Exactive 質譜儀(美國Thermo Scientific公司); LSM 880 with Airyscan 激光掃描共聚焦顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)。

4'-羥基-4-氰基聯苯(95%，北京百靈威科技有限公司); 2-氨甲基吡啶(97%，上海韶遠化學科技有限公司); 其它試劑均為分析純。金屬離子儲備液均為其相應的硝酸鹽或氯化物水溶液(1.0×10-2mol/L); 陰離子儲備液均為其相應的鉀鹽或鈉鹽水溶液(1.0×10-2mol/L); 探針儲備液濃度為1.0×10-3mol/L。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 探針HPBC的合成

3'-甲酰基-4'-羥基-4-氰基聯苯根據文獻[23]的方法合成，如Scheme 1所示，得到白色的固體產物。1H NMR (DMSO-d6)δ(ppm): 11.05 (s, 1H, OH), 10.33(s, 1H, CHO), 8.02 (s, 1H, ArH), 7.95 (d, 1H, ArH), 7.91 (d, 2H, ArH), 7.86 (d, 2H, ArH), 7.15 (d, 1H, ArH)。

Scheme 1 HPBC的合成路線Scheme 1 Synthesis of 4'-hydroxy-3'-((2-pyridin-2-ylmethylimino) methyl)-4-biphenyl carbonitrile (HPBC)

2.3 紫外和熒光光譜實驗

紫外吸收光譜實驗中，HPBC濃度均為40 μmol/L; 熒光光譜實驗中，HPBC濃度均為4 μmol/L。探針HPBC檢測Zn2+的光譜實驗均在 乙醇-H2O(2∶3，V/V, HEPES, pH=7.4)體系中進行; 檢測CN-的光譜實驗均在DMSO-H2O(3∶7，V/V)體系中進行。在比色管中配制5 mL一定濃度的HPBC溶液，然后向其中滴加離子溶液進行滴定實驗。以硫酸奎寧(ΦF=0.54)為標準參照物，分別測定HPBC中加入Zn2+和CN-前后的熒光量子產率。

2.4 細胞實驗

利用肝癌細胞BEL-7402進行體外細胞實驗。在37℃，含5% CO2的環境條件下，將細胞置于10%胎牛血清的培養基中培育。向含有細胞培養液的培養基中加入3.0×10-5mol/L探針HPBC溶液，孵育30 min后，用細胞培養液清洗細胞。在激發波長405 nm、40×物鏡的激光共聚焦顯微鏡下，觀察HPBC的細胞熒光成像圖。繼續加入1.5×10-4mol/L Zn2+溶液，在相同條件下孵育，清洗后，觀察HPBC+Zn2+的細胞熒光成像圖。

2.5 CN-試紙條的制備和CN-檢測

將濾紙浸泡在1.0 mmol/L HPBC的DMSO溶液中，一段時間后取出晾干，制成試紙條。隨后將浸有HPBC的試紙條分別浸泡在不同濃度的CN-的溶液中，在自然光和紫外燈下觀察試紙條的變化。

3 結果與討論

3.1 探針HPBC對Zn2+的識別檢測

3.1.1Zn2+對HPBC光譜的影響在EtOH-H2O(2∶3，V/V, HEPES, pH=7.4)體系中測定了Zn2+對HPBC的紫外-可見吸收光譜及熒光光譜的影響。如圖1A所示，HPBC在283 和413 nm處分別有較強和較弱的兩個吸收峰，并在328 nm處存在較寬的肩峰。隨著Zn2+的加入，位于283和413 nm處的吸收峰逐漸降低，而在328 nm處的吸收峰顯著增強，同時在277、305和404 nm處出現等吸收點。吸收峰的變化可能是由于探針分子中的酚O原子與Zn2+結合，使分子內電荷轉移效應(ICT)發生變化所致。當Zn2+濃度與探針濃度相同時，328 nm處的吸收趨于穩定并達到最大，說明HPBC與Zn2+形成了1∶1的絡合物。

圖1 在EtOH-H2O(2∶3 V/V, HEPES, pH=7.4)體系中，(A) HPBC(40 μmol/L)的紫外吸收光譜隨Zn2+ (0～1 equiv.)濃度的變化，插圖為HPBC在328 nm處的吸收強度隨Zn2+濃度的變化; (B) HPBC(4.0 μmol/L)的熒光光譜隨Zn2+ (0～5 equiv.)濃度的變化，插圖為HPBC在465 nm處的熒光強度隨Zn2+濃度的變化及用365 nm的紫外燈下激發，HPBC在加入Zn2+前后的熒光改變。Fig.1 (A) Absorption spectra of HPBC (40 μmol/L) in the presence of Zn2+ (up to 1 equiv.). Inset is plot of changes in absorption intensity at 328 nm with increase of Zn2+ concentration. (B) Fluorescence titration of HPBC (4.0 μmol/L) with different concentrations of Zn2+ (0-5 equiv.) in EtOH-H2O (2∶3, V/V, HEPES, pH 7.4). Inset is changes of emission intensity at 465 nm and change in color of HPBC observed under a 365 nm UV lamp following addition of Zn2+.

圖2 297 nm的LED燈激發下，(a) HPBC(4.0 μmol/L)和(b) HPBC(4.0 μmol/L)-Zn2+(8.0 μmol/L)的熒光衰減曲線Fig.2 Fluorescence decay curves of (a) HPBC (4.0 μmol/L) and (b) HPBC(4.0 μmol/L)-Zn2+(8.0 μmol/L) obtained under a light emitting diode Lamp of 297 nm

3.1.2HPBC對Zn2+的熒光測定考察了pH值對HPBC和HPBC-Zn光譜的影響， 結果表明，HPBC-Zn的熒光對pH值有很強的依賴性。在pH 7～9范圍內，熒光信號趨于穩定(見電子版文后支持信息圖S1)。這為實現生物檢測提供了可能性。實驗選擇pH=7.4的HEPES緩沖溶液調節測定體系的pH值。

考察了HPBC檢測Zn2+的選擇性。如圖3A所示，當HPBC中加入常見金屬離子K+、 Ca2+、 Na+、 Mg2+、 Al3+、 Hg2+、 Ag+、 Pb2+、 Cd2+、 Cr3+、 Fe3+、 Ni2+、 Co2+、 Cu2+、Zn2+后，只有Zn2+使探針熒光顯著增強，表明HPBC可以選擇性識別Zn2+。為了探究HPBC 對Zn2+的實際檢測能力，考察了在其它金屬離子共存的條件下，Zn2+對HPBC熒光強度的影響。如圖3B所示，除Co2+、Cu2+可猝滅體系的熒光外，其它金屬離子的存在均不會對HPBC-Zn2+熒光發射強度產生明顯影響。進一步考察了Zn2+分別與Co2+、Cu2+共存時HPBC的紫外光譜變化(見電子版文后支持信息圖S2)，結果表明，這兩種離子共存時，HPBC中的N、O原子會競爭性絡合Co2+和Cu2+[26]，而這兩種離子具有順磁性，可能與配體之間發生電子或能量轉移而導致HPBC熒光猝滅。

圖3 (A) HPBC (4.0 μmol/L)對金屬離子(8.0 μmol/L)的選擇性; (B) Zn2+(8.0 μmol/L)與其它金屬離子(8.0 μmol/L)共存時，HPBC (4.0 μmol/L)在468 nm處的熒光強度Fig.3 (A) Emission spectra of HPBC (4.0 μmol/L) in the presence of various metal ions (8.0 μmol/L). (B) Fluorescence intensities of HPBC (4.0 μmol/L) at 468 nm upon addition of Zn2+ (8.0 μmol/L) in the presence of interfering metal ions (8.0 μmol/L)

測定了HPBC對Zn2+的熒光滴定曲線。圖1B插圖表明，體系在468 nm處的熒光強度與Zn2+濃度在0.4～4.0 μmol/L范圍內有良好的線性關系(R2=0.9978)，檢出限為36.5 nmol/L(3σ/S)，低于國標GB 5749-2006《生活飲用水衛生標準》規定的飲水中Zn2+含量的限量值1.0 mg/L(約15 μmol/L)[14]，比WHO規定飲用水中Zn2+限量水平(76 μmol/L)低約1000倍[27]。將HPBC與文獻報道的席夫堿型Zn2+熒光探針進行比較(見電子版文后支持信息表S1)，結果表明，本研究中探針HPBC的合成方法簡單，可以高效識別檢測水體系中的Zn2+，具有較高的靈敏度。

圖4 向HPBC中交替加入Zn2+與EDTA的熒光變化。[HPBC]=4.0 μmol/L, [Zn2+]=8.0 μmol/L, [EDTA]=8.0 μmol/L。插圖為紫外燈下相應熒光變化。Fig.4 Fluorescence intensity changes of HPBC upon alternate addition of Zn2+ and EDTA, [HPBC]=4.0 μmol/L, [Zn2+]=8.0 μmol/L, [EDTA]=8.0 μmol/L. Inset shows the corresponding visual fluorescent color changes

采用乙二胺四乙酸二鈉鹽(Na2EDTA)研究了HPBC檢測Zn2+的可逆性。向HPBC中交替加入Zn2+和EDTA，HPBC表現出“ON-OFF-ON”模式的熒光變化(圖4)，且在4次循環后，體系熒光效率損失較小，表明HPBC對Zn2+的識別檢測具有良好的可逆性。

3.1.3HPBC與Zn2+的結合模式采用熒光等摩爾連續變化法(電子版文后支持信息圖S3A)測定，顯示HPBC與Zn2+的絡合比為1∶1。根據熒光滴定的實驗結果(電子版文后支持信息圖S3B)，利用Benesi-Hildebrand方程計算得出HPBC與Zn2+的結合常數為2.75×104L/mol，高分辨質譜分析進一步證明了此結論。圖5質譜圖中峰m/z407.79179為HPBC-H++Zn2++CH3OH(計算值：m/z408.06904)。

圖5 HPBC-Zn2+的高分辨質譜Fig.5 Mass spectra of HPBC in the presence of Zn2+

圖6 探針HPBC與Zn2+核磁滴定圖及其結合模式圖Fig.6 Partial 1H NMR spectra of HPBC in the presence of different concentrations of Zn2+ (NO3)2·6H2O in d6-DMSO

3.1.4細胞熒光成像利用熒光共聚焦顯微鏡考察了HPBC與Zn2+在肝癌細胞(BEL-7402)中的成像。如圖7所示，細胞與HPBC(30 μmol/L)共培養30 min后，不發射熒光。當HPBC預處理過的BEL-7402細胞與Zn2+(0.15 mmol/L)培養30 min后，細胞發射強烈的藍色熒光，表明HPBC可以有效地檢測細胞內的Zn2+。

圖7 BEL-7402細胞熒光成像圖：(A) 細胞與HPBC(30 μmol/L)共同孵育30 min; (B) HPBC (30 μmol/L)與細胞孵育后，再與Zn2+(0.15 mmol/L)共孵育30 min。(1)明場成像;(2)暗場成像;(3)疊加成像Fig.7 Fluorescence images of BEL-7402 cells treated with HPBC and Zn2+. (A) cell incubated with HPBC (30 μmol/L) for 30 min. (B) cell pre-incubated with HPBC (30 μmol/L) for 30 min and then treated with 0.15 mmol/L Zn2+. (1) Bright field image; (2) fluorescence image and (3) merged image

3.2 探針 HPBC對CN-的識別檢測

3.2.1HPBC對CN-的傳感識別考察了DMSO-H2O溶劑中陰離子對HPBC光譜的影響。發現探針對陰離子的光譜響應與DMSO-H2O中水的含量有關，最終選擇了與其它陰離子相比對CN-有很好選擇性的DMSO-H2O(3∶7,V/V)作為測定溶劑。

探針的紫外-可見吸收光譜在257、288、335和395 nm處有4個吸收峰(圖8A)。當向探針HPBC中逐量加入CN-時，HPBC在257和288 nm處的吸收峰逐漸減弱，而在335及395 nm處的吸收峰增強，溶液顏色由無色變為淡黃色，同時在307 nm處產生一個等吸收點，表明生成了一個穩定的新物種。

如圖8B所示， 激發波長為335 nm時，由于探針分子存在ESIPT效應，HPBC(ΦF=0.05)在510 nm處熒光很弱。逐漸加入CN-后，體系在510 nm的綠色熒光增強(ΦF=0.18)。熒光的增強可能是由于CN-使HPBC中的酚羥基去質子化，抑制了ESIPT效應。同樣測定了體系在加入CN-前后熒光壽命的變化(電子版文后支持信息圖S4)。在DMSO-H2O(3∶7,V/V)體系中，在297 nm激發波長下， 測得HPBC的平均熒光壽命為0.36 ns，當與CN-作用后，熒光壽命為2.12 ns。計算得到HPBC的kr=1.39×108s-1，knr=2.64×109s-1。而加入CN-后的kr=8.49×107s-1，knr=3.87×108s-1，表明當探針中加入CN-，kr/knr比值增大，因而熒光增強。

圖8 DMSO-H2O (3∶7, V/V)中(A) HPBC (40 μmol/L)紫外吸收光譜隨CN-濃度(0～10 equiv.)的變化; (B) HPBC(4.0 μmol/L)熒光光譜隨CN- (0～40 equiv.)濃度的變化Fig.8 (A) Absorption titration of HPBC (40 μmol/L) with different concentrations of CN- (0-10 equiv.) in DMSO-H2O (3∶7, V/V). Inset shows color change of HPBC in the presence of CN-. (B) Fluorescent spectra of HPBC (4.0 μmol/L) in the presence of CN- (0-40 equiv.). Inset shows emission intensity at 510 nm upon addition of different amount of CN- and change in color of HPBC observed under a UV lamp following addition of CN-

圖9 (A) HPBC(4.0 μmol/L)對陰離子(80 μmol/L)的熒光選擇性，(B) CN-(80 μmol/L)與其它陰離子(80 μmol/L)共存時，HPBC(4.0 μmol/L)的熒光強度Fig.9 (A) Fluorescence spectra of HPBC(4.0 μmol/L) respectively upon addition of several anions(80 μmol/L). (B) Fluorescence intensities of HPBC(4.0 μmol/L) in the presence of CN-(8.0 μmol/L) with other anions(80 μmol/L).

圖10 探針HPBC與KCN核磁滴定圖Fig.10 Partial 1H NMR spectra of HPBC in the presence of different concentrations of KCN in d6-DMSO

表1 自來水樣品中CN-的檢測

Table 1 Determination of CN-in tape water samples

樣品Samples加入量Added(μmol/L)檢測含量Found(μmol/L)回收率Recovery(%)相對標準偏差RSD(%，n=5)10---21．501．58105．01．4538．008．18102．00．94424．023．798．91．84

3.2.2實際樣品中CN-的分析采用HPBC對飲用水中的CN-進行了測定， 加標回收率為98.9%～105.0%(表1)， 表明本方法可用于實際水樣中CN-的檢測。

將HPBC制作成試紙條，用于CN-的傳感識別。利用HPBC的試紙條檢測水樣中的CN-，結果如圖11所示，可以觀察到較明顯的顏色及熒光變化。因此，探針HPBC能夠通過試紙條的方式方便快捷地檢測CN-。

圖11 自然光(A)和紫外燈(365 nm)(B)下試紙條對不同濃度CN-的檢測結果Fig.11 HPBC-based test strips upon addition of CN- under (A) natural light and (B)365 nm UV lamp

4 結 論

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