蛋白質雜化熒光金納米簇的制備及在汞離子快速檢測中的應用

彭 濤 王見一 謝三磊 姚 凱 孫淑娟 曾于洋 江海洋

(中國農業大學動物醫學院， 北京 100193)

1 引 言

貴金屬熒光納米簇是一種新型熒光納米材料，由幾個到幾百個原子組成，粒徑約為0.2～3.0 nm，接近電子的費米波長，呈現獨特的光學、電學、化學等特性，在生物分析成像、環境監測等領域有廣闊的應用前景[1～3]。熒光金納米簇(AuNCs)具有較強的光致發光、良好的光穩定性、大的斯托克斯位移和高的熒光量子產率，是目前研究最廣泛的貴金屬熒光納米簇，已被用于過氧化氫[4]、金屬離子[5]、茶多酚[6]等的檢測。2009年，Xie等[7]以牛血清白蛋白(BSA)為配體，在溫和的條件下制備出具有紅色熒光特性的蛋白質雜化熒光金納米簇(AuNCs@BSA)。目前，已有多種有機物用于AuNCs的合成，如樹枝狀分子或高聚物(聚酰胺、聚乙稀亞胺等)、氨基酸(脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等)、轉鐵蛋白、酶(辣根過氧化物酶、胰蛋白酶、溶菌酶、胃蛋白酶等)及一些小分子物質(硫辛酸、二硫蘇糖醇)等[8]。因為BSA原料易得，且以BSA為配體合成AuNCs的過程簡單、條件溫和，所以AuNCs@BSA在很多領域應用廣泛[9～11]。

重金屬在生態環境中不易降解，且容易聚集在生物體內，通過食物鏈傳遞進入人體內，對人類健康有潛在的致癌和致畸等毒性[12]。汞離子(Hg2+)是一種常見的重金屬污染物，廣泛存在于水體、土壤及食物中，Hg2+容易聚集在生物體內，對動物和人的大腦、神經系統、生殖系統以及腎臟都有較強的毒性[13,14]。我國衛生部規定飲用水中Hg2+含量不可超過1.0 μg/L[15]。目前，Hg2+的檢測方法包括電化學法[16]、比色法[17]、原子吸收光譜法[18]、質譜法等[19]，但是這些方法大多檢測過程繁瑣、周期長。因此，建立一種快速、靈敏、便捷的Hg2+檢測方法具有重要的實際應用價值。

文獻[20]報道，Hg2+可使AuNCs@BSA的熒光發生不可逆轉的猝滅，所以AuNCs@BSA可作為一種熒光探針用于檢測Hg2+。本研究以BSA作為穩定劑和還原劑，在溫和的條件下, 采用一步法將氯金酸還原，合成具有紅色熒光的AuNCs@BSA，并以其為熒光檢測探針檢測水中Hg2+。將此探針用于自來水中的Hg2+的快速靈敏檢測，結果令人滿意。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

恒溫磁力攪拌器(德國Heigoph公司)； WFH-203 (ZF-1)三用紫外分析儀(上海馳唐實業有限公司)；SpectraMax M5多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

牛血清白蛋白(BSA， 99.9%)、三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)、汞標準溶液(10 mg/mL),均購自美國Sigma-Aldrich公司)；膠體金(實驗室制備)[21]；其它試劑均為分析純，實驗用水為雙蒸水(18.2 MΩ·cm，美國Millipore公司純水儀制備)。

2.2 AuNCs@BSA的合成

所有玻璃儀器經重鉻酸溶液浸泡24 h后，用雙蒸水沖洗干凈。根據文獻[6]方法合成AuNCs@BSA。將BSA溶液(50 g/L)和HAuCl4溶液(0.01 mol/L)在37℃等體積混合(共12 mL)，磁力攪拌反應2 min后，逐滴加入1 mol/L NaOH溶液調節pH值至12.0，在37℃條件下攪拌反應12 h，溶液顏色由亮黃色變為棕黃色。將制備好的AuNCs@BSA用透析袋(100 kDa，美國Sigma-Aldrich公司)在雙蒸水中透析12 h后，用無菌離心管收集(約15 mL)，在4℃保存，于3個月內使用。

2.3 離子檢測方法

將制備好的AuNCs@BSA用雙蒸水稀釋100倍后，加入酶標板各孔中(50 μL/孔)，然后加入50 μL樣品，反應2 min后，用多功能酶標儀掃描記錄各孔在360 nm激發光下的熒光發射光譜。

2.4 檢測參數優化

以添加了Hg2+(1 μg/L)的空白樣品為陽性對照，綜合考慮陰性樣品的熒光強度及陽性樣品的抑制率(Inhibition rate,I, %)，確定最優AuNCs@BSA的用量、檢測體系的離子濃度及pH值。抑制率計算公式如下：

I(%)=(1-F/F0)×100%(1)

其中，F和F0分別為陰性和陽性樣品的熒光強度。

3 結果與討論

3.1 AuNCs@BSA的表征及性能評價

AuNCs@BSA、BSA溶液、HAuCl4溶液、膠體金溶液在365 nm的紫外燈下的照片如圖1A所示，只有AuNCs@BSA溶液發出明顯的紅色熒光。熒光光譜表征結果(圖1B)表明，AuNCs@BSA的最大激發波長和發射波長分別為360和635 nm。高分辨掃描電鏡表征結果如圖1C所示，AuNCs@BSA呈現規則的單分散球形，粒徑為(2.00 ± 0.05) nm。根據文獻[22]報道，超小粒徑的金屬熒光納米簇具有類過氧化物酶的生物催化性。分別取500 μL H2O2和TMB溶液混勻后，加入100 μL純化后的BSA@AuNCs溶液，5 min后，溶液由無色變為藍色(圖1D)。以上結果均表明成功合成了蛋白質雜化的熒光金納米簇[23]。因為AuNCs@BSA的粒徑接近電子的費米波長，它的能級譜帶變得不連續，成為不連續的離散能級，電子可在各能級間發生躍遷，從而表現出熒光性質[2]。如圖1E所示，在AuNCs@BSA加入Hg2+標準品，其熒光發射光譜明顯降低，證明Hg2+可猝滅AuNCs@BSA的熒光。

圖1 AuNCs@BSA表征結果： (A) 紫外燈(360 nm)下的照片；(B) 激發和發射光譜圖；(C) 透射電鏡表征圖；(D)過氧化物模擬酶活性；(E) Hg2+猝滅AuNCs@BSA熒光。Fig.1 Characterizations of AuNCs@BSA: (A) Image under UV light illumination, (B) fluorescent spectrum, (C) transmission electron microscopy (TEM) image , (D) mimic peroxidase activiety and (E) fluorescence quenched by Hg2+.

3.2 AuNCs@BSA熒光猝滅檢測自來水中汞離子的參數優化

以上實驗結果表明，Hg2+可以猝滅AuNCs@BSA的熒光。采用單一變量法對AuNCs@BSA的稀釋倍數及用量、檢測體系的pH值等參數進行了優化。如圖2A所示，分別用雙蒸水(ddH2O)、0.05 mol/L嗎啉乙磺酸緩沖液(MES，pH 6.0)、0.05 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH 6.0)、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.0)、0.05 mol/L Tris-HCl(pH 6.0)、0.05 mol/L硼酸緩沖液(BB，pH 6.0)、0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(CB，pH 9.6)共7種溶液作為AuNCs@BSA稀釋液。結果表明，以ddH2O為稀釋液時，陰性熒光強度和陽性抑制率均最佳。分別將AuNCs@BSA用ddH2O稀釋10、20、40、60、80、100、150和200倍后進行檢測，結果表明，隨著AuNCs@BSA在體系中的用量增加，熒光強度增強，但是陽性抑制率變化不規律，當AuNCs@BSA稀釋100倍后檢測，陽性抑制率最高(圖2B和2C)。 隨pH值增加，陰性樣品AuNCs@BSA的熒光強度沒有明顯變化，但當pH=5.0時陽性抑制率最高(圖2D)。

圖2 緩沖體系(A)、稀釋液體積(B)、稀釋倍數(C)和pH值(D)對檢測體系的影響Fig.2 Optimization of (A) buffer system, (B) dilution solution volume, (C) dilution folds and (D) pH value

本方法選擇pH=5.0的ddH2O將AuNCs@BSA稀釋100倍后檢測Hg2+，靈敏度較高。

3.3 標準曲線及檢測限定

由不同濃度的Hg2+標準溶液(0、 0.5、 1、 5、 10、 50、 75、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800和900 μg/L)的熒光光譜圖(圖3A)可見，隨著Hg2+濃度增加，體系在635 nm處的熒光強度下降；以Hg2+濃度為橫坐標，相應的熒光強度為縱坐標繪制標準曲線，如圖3B所示，在75～900 μg/L之間，Hg2+濃度和熒光強度有良好的線性關系y=-0.27x+ 762.02(R2=0.9959)；在低濃度范圍(0.5～75 μg/L)，熒光強度和Hg2+的濃度對數成反比例關系，線性方程為y=-26.76lgx+ 803.1(R2=0.9951)，檢出限(LOD)為0.14 μg/L(3σ)，低于國標規定的自來水中Hg2+的限量水平(1.0 μg/L)。如表1所示，與同類的金屬納米簇熒光法[26,27]相比，本體系檢出限較低，線性范圍較寬，且檢測時間短。

圖3 不同濃度Hg2+的熒光光譜圖(A)及線性關系曲線(B)，插圖為0.5～75 μg/L范圍內的校正曲線。Fig.3 Fluorescent spectra of the detection system in the presence of different concentrations of Hg2+ (A) and calibration curve (B). Inset is calibration curve in low concentration range (0.5-75 μg/L)

表1 不同檢測方法檢測Hg2+的性能比較

Table 1 Comparison of different methods for Hg2+detection

檢測方法Methods檢測時間Detectiontime(min)線性范圍Linearrange(μg/L)檢出限LOD(μg/L)參考文獻References金納米簇熒光法Goldnanoclustersbasedfluorescentassay30．5～7575～9000．141本方法Thiswork金納米簇熒光法Goldnanoclustersbasedfluorescentassay239．6～668．81200～17604．64[26]銅納米簇熒光法Coppernanoclustersbasedfluorescentassay302．4～481．76[27]比色法和熒光法化學傳感器Colorimetricandfluorescentchemosensor-0～4000～40015．311．8[28]比色法Colorimetricassay>20-0～2．40．008～20．4960．0312[29][30]表面增強拉曼散射Surface?enhancedRamanscattering>60-0．02[31]試紙條傳感器Stripbiosensor>608×10-5～88×10-5[32]

3.4 特異性實驗

圖4 特異性實驗結果(A)及Cu2+干擾消除(B)Fig.4 (A) Specificity and (B) elimination of interference of Cu2+

3.5 實際樣品分析

對北京海淀區不同區域的10個自來水樣本，用本方法對樣本中的Hg2+進行快速檢測，10個樣本均未檢出。在空白自來水樣品中分別添加0.5、 5、 10、 50和100 μg/L的Hg2+標準品，用本方法進行檢測，回收率在86.8%～113.4%之間(n=3)，相對標準偏差小于15%，表明本方法實用性良好。

4 結 論

本研究通過一步法合成了具有紅色熒光的蛋白質雜化納米簇，其熒光能被Hg2+有效猝滅。通過對檢測條件進行優化，建立了快速、 靈敏、 便捷、 準確的自來水中的Hg2+的熒光檢測方法，檢出限低于國標對于自來水中Hg2+的限量值，可用于自來水中Hg2+的檢測。

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