高靈敏度席夫堿鎂離子熒光探針的合成及識別性能研究

吳紅梅 郭 宇 曹建芳 陳強強

(遼寧工業大學化學與環境工程學院，錦州121001)

1 引 言

鎂離子(Mg2+)是細胞中含量位居第二位的生物離子，具有十分重要的生理功能。Mg2+能夠參與核酸和蛋白質的合成及能量代謝、 調控細胞的分化、 增強酶的催化功能，通過影響Ca2+和K+的轉運調控傳遞信號，與細胞中的三磷酸腺苷(ATP)結合后在肌肉收縮和主動運輸方面發揮重要的作用[1,2]。人體中Mg2+濃度的變化對細胞生理活動會產生重要的影響，并會引起一些疾病的發生[3,4]。因此， Mg2+的檢測方法的研究在生理學、 營養學、 臨床醫學、 化學和環境學等領域具有重要意義。

目前，雖然金屬離子的檢測方法較多，但仍有一些問題尚待解決。EDTA絡合滴定法不僅消耗試劑、 耗時費力，而且受其它金屬離子干擾嚴重[5]。原子吸收法較為精確、 靈敏，但從機理上難以區分金屬離子是以鍵合形式還是游離形式存在[6]。電子探針微量分析不能測定鍵合或自由金屬離子濃度，只能測定干細胞內的離子濃度[7]。核磁共振法可以精確測定自由金屬離子濃度，但無法得到金屬離子在細胞內的分布信息[8]。相對于上述檢測方法，熒光探針法以操作簡便、 高靈敏度、 高選擇性、 實時監測和原位成像等特點，逐步發展為金屬離子檢測的常用方法[9～13]。目前，已經發展了冠醚類[14]、 羅丹明類[15]、 香豆素類[16]、 二酮類[17]和喹啉類[18]等Mg2+熒光探針，然而，有些探針合成復雜; 此外，Mg2+和Ca2+化學性質相似，導致檢測Mg2+時容易受到Ca2+干擾。因此，合成簡單、 高選擇性和高靈敏度的Mg2+熒光探針仍具有一定的挑戰性和良好的實際應用價值。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Varian INOVA-400MHz核磁共振儀(美國Varian公司，TMS為內標); X-6顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司); HP8453紫外可見光譜儀、 HPLC-Q-Tof MS 型質譜儀(美國Agilent公司); JASCO FP-6500熒光光譜儀(英國Edinburgh Instruments公司); Elementar varioEL Ⅲ 元素分析儀(德國Elementar公司)。

2-羥基-1-萘醛、 4-氨基苯甲酸甲酯、 丹磺酰氯(分析純，北京百靈威科技有限公司); 無水Na2SO4(分析純，濟寧百川化工有限公司); 三乙胺、 冰醋酸、 氯化亞砜、 水合肼、 乙酸乙酯、 甲醇、 丙酮、 乙醇、 乙腈、 二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、 乙醚(分析純，國藥集團化學試劑有限公司); 實驗用水為去離子水。

2.2 鎂離子熒光探針TZ的合成

鎂離子熒光探針TZ的合成路線見圖1。4-氨基苯甲酸甲酯和丹磺酰氯反應生成化合物A1(4-(1-(二甲基氨基)萘-5-磺酰胺基)苯甲酸甲酯)，A1再與水合肼作用生成A2(4-(1-(二甲基氨基)萘-5-磺酰胺基)苯甲酰肼)，最終A2與2-羥基-1-萘醛進行Schiff's bases反應合成了鎂離子熒光探針TZ。

圖1 鎂離子熒光探針TZ的合成路線Fig.1 Synthetic route of fluorescent probe TZ for detection of magnesium ions

2.2.1化合物A1的合成稱取5 g(33.1 mmol)4-氨基苯甲酸甲酯置于250 mL燒瓶中，加入60 mL二氯甲烷溶解，再加入適量三乙胺，利用恒壓漏斗將溶解在二氯甲烷中的丹磺酰氯逐滴加入到上述溶液中，反應24 h后用水萃取，有機相經無水Na2SO4干燥后，旋轉蒸發得到黃色粉末產品，產率50.13%。

2.2.2化合物A2的合成將化合物A1放入燒瓶中，加入過量的水合肼(80%)回流24 h，除去反應液得到油狀物，將油狀物用乙醚超聲處理后得到黃色粉末，產率90.0%。

2.2.3鎂離子熒光探針TZ的合成在冰醋酸催化下，將化合物A2與2-羥基-1-萘醛以1∶1.2的摩爾比在甲醇溶液中回流24 h，除去反應液得到黃色粉末產品，產率82.3%。熔點: 274.6℃～275.3℃; ESI-MS:m/z537.14歸屬于[TZ-H]-，m/z573.11歸屬于[TZ+Cl]-; 元素分析計算值: C，66.90%; N，10.40%; H，4.87%; 實驗值: C，66.92%; N，10.36%; H，4.86%;1H NMR譜(d6-DMSO)，δ: 2.80 (6H，d)，7.25 (4H, m)，7.42 (1H, t，J(H, H)=7.6 Hz)，7.67 (3H, m)，7.79 (2H，d，J(H, H)=8.4 Hz)，7.93 (2H，m)，8.18 (1H, d,J(H, H)=8.8 Hz)，8.37 (2H, m)，8.48 (1H，d，J(H,H)=8.8 Hz)，9.39 (1H，HCH=N, s)，11.22 (1H，HSO2NH, s)，12.01(1H, HOH, s)，12.73 (1H, HCONH, s)。

2.3 光譜測試

2.3.1溶液的配制探針TZ溶液的配制: 首先配制1.0×10-3mol/L高濃度探針TZ的DMF溶液，然后用DMF-H2O(9∶1,V/V)稀釋，得到用于熒光和紫外光譜測試的低濃度TZ溶液。

各種金屬離子溶液的配制: 首先配制0.02 mol/L的高濃度金屬離子溶液，根據測試需要用去離子水將其稀釋到特定濃度。

2.3.2紫外光譜滴定移取2 mL 20 μmol/L探針TZ溶液加入到光程1 cm的比色皿中，然后用微量注射器由低倍數到高倍數逐步加入金屬離子(總量少于100 μL)，測定300～600 nm波長范圍的吸收光譜變化，直至平衡。

2.3.3熒光光譜滴定移取2 mL 1 μmol/L 探針TZ溶液加入到1 cm寬的比色皿中，用Mg(NO3)2溶液滴定(由低到高倍數，總量少于100 μL)，以400 nm的光激發，狹縫寬度為1 nm，測定400～700 nm范圍內熒光發射光譜變化，直至平衡。

2.3.4量子產率測定采用的Rhodamine 6G[26](量子產率0.94，溶劑為乙醇)為參照測定熒光量子產率，TZ+ Mg2+的激發波長為400 nm。TZ+ Mg2+的量子產率通過公式(1)計算得出為0.57。

(1)

其中，φstd和φunk分別為參比標準樣品和待測樣品的熒光量子產率，Astd和Aunk分別為參比標準樣品和待測樣品在激發波長處的吸光度，Iunk和Istd分別參比標準樣品和待測樣品的歸一化熒光強度，ηstd和ηunk分別參比標準樣品和待測樣品溶劑的折射率。

3 結果與討論

3.1 TZ-Mg2+的電噴霧質譜(ESI-MS)分析

向探針TZ中加入硝酸鎂后的電噴霧質譜圖如圖2所示， 質譜峰m/z593.3593歸屬為 [Mg + TZ + CH3OH]+;m/z625.3810歸屬為物種[Mg +TZ + NO3]+，與Isopro3.0program軟件的模擬結果相吻合，說明探針TZ與Mg2+的螯合模式為1∶1，并且在溶液中能夠穩定存在。

圖2 向探針TZ中加入Mg(NO3)2的電噴霧質譜(ESI-MS)圖Fig.2 Electrospray ionization mass spectrum (ESI-MS) of TZ in the presence of Mg(NO3)2

3.2 紫外光譜分析

圖3為向探針TZ溶液(DMF-H2O(9∶1,V/V))中加入Mg2+的紫外滴定曲線。從圖3可見，探針TZ在386.5 nm出現了較寬的吸收帶，為2-羥基-1-萘醛的特征吸收，是萘醛π-π*躍遷的結果。當加入Mg2+后，在411 nm處出現新的吸收峰，并且吸收峰的強度逐漸增強，最后達到平衡，這主要是由于探針TZ與Mg2+配位后產生電荷躍遷的結果，等吸收點為400 nm，表明溶液中只有TZ和TZ-Mg兩種物種共存。

圖3 向探針TZ溶液(20 μmol/L)中加入不同濃度Mg2+的紫外-可見滴定曲線。 插圖: (a) TZ與Mg2+配位的Job's plot圖; (b) 平衡常數擬合曲線Fig.3 Absorption spectra of TZ (20 μmol/L) upon the addition of Mg2+ in DMF-H2O(9∶1, V/V). Inset: (a) Job's Plot analysis of TZ with Mg2+ in DMF-H2O(9∶1, V/V) solution; (b)the linear fitting curve of the UV-Vis titration at 411 nm

圖3插圖a為探針TZ與Mg2+配位的Job's plot 曲線圖，保持探針TZ和Mg2+總濃度不變(20 μmol/L)，測定Mg2+與探針TZ不同比值時的紫外吸收強度，[TZ]/[TZ+Mg2+]=0.5處紫外吸收峰強度最大，說明TZ與Mg2+以1∶1的比例配位，這也進一步驗證了ESI-MS譜圖的結果。根據1∶1的配位比例，利用圖3紫外滴定曲線中411 nm處的吸收峰強度數值, 通過Origin軟件進行線性擬合(圖3插圖b)，計算出探針TZ與Mg2+配位的平衡常數為1.34×106L/mol。

3.3 熒光光譜分析

采用理論計算的方法進一步研究探針TZ對Mg2+的識別機制，如圖6所示。所有的理論計算結果均利用高斯09軟件完成，基態幾何優化結構采用密度泛函理論方法，B3LYP泛函，6-31G(d，p)基組和PCM溶劑化模型并在水溶液中進行計算。實驗數據顯示，探針TZ識別Mg2+的信號主要來自2-羥基-1-萘醛發出的熒光。由圖6可知，在加入Mg2+之前，2-羥基-1-萘醛存在PET過程，配位基團的LUMO能級恰巧介于2-羥基-1-萘醛的HOMO和LUMO能級之間，阻礙了2-羥基-1-萘醛LUMO軌道到HOMO軌道的電子回遷，不產生熒光; 當加入Mg2+后， 配位基團的LUMO能級升高，HOMO能級降低，使2-羥基-1-萘醛的LUMO軌道到HOMO軌道很容易發生電子回遷，PET過程消失，發出2-羥基-1-萘醛的熒光，實現了對Mg2+的識別。此理論計算結果與熒光測試結果(圖4)一致。

圖4 (A) 激發波長分別為350和400 nm時探針TZ的熒光發射光譜圖; (B)在探針TZ(1 μmol/L)中逐漸加入Mg2+的熒光強度的變化，λex=400 nm。插圖為Mg2+加入量與熒光強度的關系。Fig.4 (A) Fluorescent spectra of TZ at excitation wavelength of 350 and 400 nm in a solution of H2O/DMF (DMF-H2O(9∶1, V/V)), respectively, (B) Fluorescent responses of TZ upon addition of Mg2+ at excitation wavelength of 400 nm. Inset: influence of Mg2+ on the fluorescent intensity at excitation wavelength of 400 nm.

圖5 熒光探針TZ識別Mg2+的PET過程示意圖(X為配位的溶劑或陰離子)Fig.5 Schematic diagram of photoinduced electron transfer (PET) process of probe TZ for detection of Mg2+

3.4 探針TZ對Mg2+識別的線性范圍和檢出限

在1 μmol/L探針TZ溶液中逐漸加入Mg2+，Mg2+濃度在0.13～2.00 μmol/L區間與熒光強度呈良好的線性關系，如圖7所示，線性回歸方程為y=1.03997+2.1147x，線性相關系數R2=0.999，檢出限(LOD)為0.13 μmol/L。Wang等[19]合成了色酮醛縮靛紅類鎂離子熒光探針，檢出限為5.16×10-7mol/L，與其相比，本研究合成的探針TZ具有更高的靈敏度。

圖7 Mg2+濃度與熒光強度的線性擬合圖Fig.7 Linear fitting curve of the fluorescent intensity versus Mg2+ concentration upon addition of Mg2+ into TZ (1 μmol/L)

3.5 選擇性測試

圖8A為探針TZ對其它各種金屬離子選擇性測試的熒光光譜。向探針TZ (1 μmol/L)中分別加入20倍濃度其它金屬離子，在468 nm處TZ僅對Mg2+具有特定響應，而對堿金屬和堿土金屬離子K+、 Na+、 Li+、 Ca2+及過渡金屬離子Zn2+、 Mn2+、 Cd2+、 Pb2+、 Ag+和Cr3+等沒有明顯的響應，表明TZ對Mg2+具有十分優良的選擇性，原因可歸結為席夫堿探針TZ合適的配位構型，并且對Mg2+具有很強的螯合能力，絡合常數較大。

在選擇性實驗的基礎上進行了競爭性實驗，首先取2 mL探針TZ (1 μmol/L)溶液放入比色皿中，分別加入20倍的Na+、 Li+、 K+、 Ca2+、 Zn2+、 Cd2+、 Ag+、 Pb2+、 Mn2+、 Cr3+等金屬離子，在此基礎上再加入10倍Mg2+，測定在468 nm處的熒光強度。如圖8B所示，大量Na+、 Li+、 K+、 Ca2+、 Zn2+、 Cd2+、 Ag+、 Pb2+、 Cr3+和Mn2+共存時不影響探針TZ對Mg2+的檢測。可見探針TZ能夠高靈敏度、 高選擇性的識別Mg2+，具有較強的抗干擾能力。

圖8 (A)探針TZ (1 μmol/L)對不同離子(20 μmol/L)的選擇性; (B)其它離子存在下探針TZ (1 μmol/L)對Mg2+的識別, 激發波長為400 nm。Fig.8 (A)Fluorescence emission of TZ (1 μmol/L) in DMF-H2O(9∶1, V/V)upon addition of different metal ions (Mg2+, K+, Na+, Li+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, Cd2+, Pb2+, Ag+, Cr3+, 20 μmol/L, respectively) and (B) fluorescence responses of TZ (1 μmol/L) in aqueous solutions of DMF-H2O(9∶1, V/V) to 10 μmol/L Mg2+ (20 μmol/L) in the presence of above various metal ions. Excitation wavelength is 400 nm.

4 結 論

設計合成了一種新型席夫堿類熒光探針TZ，研究了探針對鎂離子的識別行為和機理。在各種金屬離子中，探針TZ僅與Mg2+結合后在發射波長468 nm處熒光強度顯著增強，增強約10倍， 量子產率高達57%，檢出限為0.13 μmol/L，實現了對Mg2+的高靈敏度和高選擇性識別，為進一步檢測生物體內Mg2+的含量和分布等研究提供了依據。

1 Leonard S S, Harris G K, Shi X L.Bio.Med.,2004, 37(12): 1921-1942

2 Henry O, Judith L.J.PeriodontalRes.,1967, 2(2): 147-153

3 Moncayo R, Moncayo H.BBAClin.,2015, 3: 44-64

4 Gao X R, Peng L Y, Adhikari C M, Lin J, Zou Z Y.J.Card.Fail.,2007, 13(3): 170-177

5 Lima R A C, Santos S R B, Costa R S, Marcone G P S, Honorato R S, Nascimento V B, Araujo M C U.Anal.Chim.Acta,2004, 518(1): 25-30

6 Tinas H, Ozbek N, Akman S.Spectrochim.ActaB,2018, 140: 73-75

7 Francesco A Di, Desnoyer R W, Covacci V, Wolf F I, Romani A, Cittadini A, Bond M.Arch.Biochem.Biophys.,1998, 360(1): 149-157

8 Wu G, Zhu J F.Prog.Nucl.Magn.Reson.Spectrosc.,2012, 61(1):1-70

9 Zhang X L, Xiao Y, Qian X H.Angew.Chem.Int.Edit.,2008, 47(42): 8025-8029

10 HE Qiang-Fang, WU Ying-Hong, CAI Zhi-Jian, XIE Wang.ChineseJ.Appl.Chem.,2016, 33(6): 701-709

何強芳, 吳映紅, 蔡志健, 謝 旺. 應用化學,2016, 33(6): 701-709

11 Wu H M, Zhou P, Wang J, Zhao L, Duan C Y.NewJ.Chem.,2009, 33(3): 653-658

12 Ghazali S, Wang J, Fan J L, Peng X J.Sens.ActuatorsB,2017, 239: 1237-1242

13 Meng Q T, Zhang X L, He C, He G J, Zhou P, Duan C Y.Adv.Funct.Mater.,2010, 20(12): 1903-1909

14 Hama H, Morozumi T, Nakamura H.TetrahedronLett.,2007, 48(10):1859-1861

15 Fan J, Zhan P, Hu M M, Sun W, Tang J Z, Wang J Y, Sun S G, Song F L, Peng X J.Org.Lett.,2013, 15(3): 492-495

16 Yeh J T, Chen W C, Liu S R, Wu S P.NewJ.Chem.,2014, 38(9):4434-4439

17 Kim H M, Yang P R, Seo M S, Yi J S, Hong J H, Jeon S J, Ko Y G, Lee K J, Cho B R.J.Org.Chem.,2007, 72(6):2088-2096

18 Xu Z, Yoon J, Spring D R.Chem.Soc.Rev.,2010, 39(6): 1996-2006

19 Wang G Q, Qin J C, Fan L, Li C R, Yang Z Y.J.Photochem.Photobiol.A,2016, 314: 29-34

20 Hosseini M, Ghafarloo A, Ganjali M R, Faridbod F, Norouzi P, Niasari M S.Sens.ActuatorsB,2014, 198: 411-415

21 Mandal S, Sikdar Y, Maiti D K, Maiti G P, Mandal S K, Biswas J K, Goswami S.RSCAdv.,2015, 5(89): 72659-72669

22 Gupta V K, Singh A K, Kumawat L K.Sens.ActuatorsB,2014, 204: 507-514

23 Ma J, Sheng R, Wu J, Liu W, Zhang H.Sens.ActuatorsB,2014, 197: 364-369

24 Mergu N, Gupta V. K.Sens.ActuatorsB,2015, 210: 408-417

25 Zhou D, Sun C, Chen C, Cui X, Li W.J.Mol.Struct.,2015, 1079(5): 315-320

26 Fiseher M, Georges.Chem.Phys.Lett.,1996, 260(1-2):115-118

27 Ray D, Bharadwaj P K.Inorg.Chem.,2008, 47(7): 2252-2254