基于生物光譜技術的污染物毒性效應研究進展

徐笠，蔚青,3，李君逸，韓麗花,3，殷敬偉，陸安祥,*

1. 北京農業質量標準與檢測技術研究中心，北京市農林科學院，北京100097 2. 農產品產地環境監測北京市重點實驗室，北京 100097 3. 中北大學理學院化學系，太原 030051 4. 清華大學摩擦學國家重點實驗室，北京 100084

應用生物光譜技術研究污染物毒性效應是毒理學研究中的一個新興領域。最常用的生物光譜技術包括紅外光譜技術(Infrared spectrometry)和拉曼光譜技術(Raman Spectroscopy)[1-2]。紅外光譜技術進行生物樣品的無損分析是一個快速發展的研究領域，而且生物大分子在構型和構象上的變化可以用來表征環境污染物對生物細胞、組織或者器官上的毒性效應，因此運用紅外光譜結合多元統計的手段，不僅可以靈敏、有效地評價污染物的毒性效應，還可以快速、準確地推斷其毒性作用機制[3-4]。拉曼光譜學是一種強大的、非侵入性的、高通量的方法，它被用來在樣本中產生化學實體的光譜代表，并且能夠檢測細胞的變化[5-6]。拉曼光譜是散射光譜，而紅外光譜則是吸收光譜，但兩者均是研究分子振動的重要手段。紅外和拉曼光譜在污染物毒性效應研究中具有靈敏度較高、檢測時間短、儀器操作簡單、所得生物信息豐富、光譜信息特征性較強和樣品前處理簡單且不造成二次污染等優勢，并且應用范圍非常廣泛，在細胞、組織和微生物等方面都可以應用，且呈現出其獨特的優勢[7-11]。本文簡要介紹了這2種技術的原理以及數據處理流程，重點介紹了這2種光譜技術在污染物毒性效應研究中的進展情況，并對未來主要的研究方向進行了展望。

1 生物光譜法概述(Overview of biospectroscopy)

生物光譜學是光譜技術在生物檢測分析中的應用，該技術不僅可以獲得樣品形態學上的結果，而且可以得到元素或分子層面的信息，成為一個新的領域學科。生物光譜法包括紅外光譜法、拉曼光譜法、熒光光譜法和X射線光譜法。目前，國內外研究學者主要是利用紅外光譜法和拉曼光譜法2種方法在污染物毒性效應方面開展了一系列研究。

1.1 紅外光譜

圖1 紅外吸收和拉曼散射分子振動原理Fig. 1 Molecular vibration principle of infrared absorption and Raman scattering

1.2 拉曼光譜

拉曼是一種單色光源的光子被吸收并釋放回來

后，分子的振動能量也隨之增加和減少的散射技術。通常情況下，有時分子不會返回到它原來的能量狀態，為了保持能量平衡，在釋放的光子中會發生頻率偏移。這種位移現象稱為非彈性散射或拉曼散射(圖1)[26]。散射分為瑞利散射與拉曼散射2種，拉曼散射包括斯托克拉曼散射(散射光頻率小于入射光頻率)和反斯托克拉曼散射(散射光頻率大于入射光頻率)，斯托克的強度遠大于反斯托克的強度，在樣品分子的拉曼光譜測試中都是以斯托克散射峰為檢測峰，忽略反斯托克散射的信號[27]。拉曼強度、拉曼頻移以及線寬都可以反映出拉曼樣品池中樣品物質的結構特征，與物質分子的化學鍵、官能團的振動和轉動有關。拉曼光譜可分為普通拉曼光譜和表面增強拉曼光譜，在使用普通拉曼光譜時，經常會遇到強烈的熒光背景(固有的或雜質引起的)，這會降低光譜的質量，并對信噪比(S/N)產生不利影響[28]。表面增強拉曼光譜(SERS)由于其增強拉曼橫截面的性質，可以提供強烈的光譜，并幫助我們克服普通拉曼的這些缺點[29]。為生物研究中的應用提供了一種快速、高靈敏度的化學結構信息檢測工具[30-32]。通常，在生物樣本中觀察到的拉曼光譜的重要區域在400～2 000 cm-1波數內，與蛋白質(1 500～1 700 cm-1)、碳水化合物(470～1 200 cm-1)、磷酸基團DNA(980、1 080和1 240 cm-1)和其他細胞生物分子的鍵合振動相關。在更高的波數(2 700～3 500 cm-1)中也可以觀察到與脂質和蛋白質中的CH、NH和OH對應的更高頻率的伸縮振動峰[33]。

表1 紅外和拉曼光譜的原理、特點及差異Table 1 Principle, characteristic and difference of Infrared Spectroscopy and Raman Spectroscopy

拉曼光譜和紅外光譜類似，同樣可以對物質的結構和性質進行定量、定性分析，不同的拉曼峰對應了不同的官能團，與紅外相比拉曼的一個突出優點是：水分對生物指紋區的拉曼信號沒有影響，因此拉曼光譜還可以用于活體成像。此外，受限于紅外光的波長衍射極限，紅外光譜顯微鏡的空間分辨率受限，一般都是微米級別以上的，而拉曼光譜可以使用短波長的激光器做激發，并結合共聚焦顯微系統，可以達到百納米級別的空間分辨率。紅外和拉曼光譜的特點及差異詳見表1。

2 生物光譜數據處理方法(Biospective data processing method)

通常生物光譜實驗采集復雜生物化學信息數據集的成百上千個差異細微的圖譜，而且由于生物樣本本身的復雜性使得圖譜中存在著很多的譜峰重疊性，因此需利用化學計量學方法對圖譜進行分析。光譜數據分析大致分為3個部分：光譜數據預處理、提取光譜信息特征、以及信息分類和光譜特征峰解析(圖2)，可以利用一些軟件對數據進行處理(表2)。

2.1 光譜數據預處理

預處理旨在提高后續多變量分析的穩健性和準確性，并通過糾正與光譜數據采集相關的問題來提高數據的可解釋性。光譜數據前處理包括剔除異常值、剪切、降噪、基線校正以及歸一化[34]。在某些情況下，光譜的目視檢查顯示出明顯的異常值，包括大量的光譜污染、熒光或非常差的S/N，可以要剔除這些明顯的異常值。樣品制備、背景熒光以及電荷耦合器件的熱波動會產生噪聲和影響光譜基線。因此，需要降低噪聲和基線校正以提高光譜質量，降噪和基線校正的第一種方法就是改變樣品制備方法以及光譜儀器的采集設置，其次還可以通過一些相應的方法進行處理。比如常用的基線校正、降噪處理方法包括直接基線校正(rubber-band correction)、多項式擬合基線校正(polynomial-correction)、一階微分(1st order differentiation)、小波降噪(wavelet-deniose)，其中直接基線校正常用于譜圖背景相對簡單的情形中，多項式擬合主要針對于復雜背景條件下的基線校正，常用于拉曼譜圖的校正，但是存在一定誤差，一階微分的方法則適用于復雜譜圖背景條件下，例如像包含熒光背景的拉曼譜圖，但是也會引入過多的噪音，而小波降噪則正好適用于含大量噪音信號成分的譜圖中，進行降噪處理[35]。歸一化紅外和拉曼光譜至關重要，以解決混淆因素，可以運用酰胺I、酰胺II、矢量歸一化、最大-最小值歸一化、標準化和中心化等方法對光譜數據進行歸一化[36]。

2.2 提取光譜信息特征

特征提取大致分為特征構造和特征選擇2種方法。特征構造是在數據中創造新特征，從而推斷出其他不太清楚的信息[37]。這對于其他同質數據集中的診斷，生物標記提取和模式識別尤為重要，并且它在高光譜成像中具有重要作用，因為單個像素可以減少與光譜強度或方差有關的單個值[38]。特征選擇是從數據集推斷現有特征，例如特定波數，可用于確定光譜生物標志物和提供診斷框架。光譜信息的特征提取包括分類、回歸、聚類和降維等相關的處理方法，常用的提取方法包括主成分分析(PCA)[39]、偏最小二乘回歸(PLS)[40]、線性判別分析(LDA)[41]、支持向量機分析(SVM)[42-43]及主成分結合線性判別分析(PCA-LDA)[1]。

2.3 信息分類和光譜特征峰解析

在成像和診斷研究中，通常需要基于光譜對樣品進行分類，因為光譜可以基于先前的用戶輸入(監督分類)或單獨的光譜方差(無監督)進行分類。無監督分類通常依賴于聚類技術，其中層次聚類分析，k均值聚類和模糊C均值聚類是3種常用的方法[44]，監督分類常見的方法包括線性判別分類器(LDCs)、人工神經網絡和支持向量機(SVMs)等[45-46]。生物樣本主要組成成分包括脂質、蛋白質、核酸和糖類等。所以解析光譜特征峰主要包括：分析脂質特征吸收峰(烷基鏈結構(CH2和CH3)、羰基及磷酸基團的振動信息)，得出與細胞膜脂質結構及膜脂過氧化程度的信息；分析蛋白質分子相關的振動信息主要包括酰胺I、酰胺II、游離氨基酸殘基及磷酸化蛋白相關的振動信息；分析酰胺I的結構可以得到蛋白質二級結構信息，分析游離氨基酸可以得到細胞內氨基酸側鏈信息及蛋白質翻譯后修飾的信息等；分析與核酸振動信息相關的吸收峰可以得到與DNA二級結構的變化情況。

3 生物光譜法應用研究進展(Progress in the application of biospectroscopy)

3.1 紅外光譜在污染物毒性效應研究進展

3.1.1 細胞毒性效應研究進展

表2 紅外和拉曼光譜數據分析軟件Table 2 Data analysis software for Infrared spectroscopy and Raman spectrum

上述研究大都側重于單一污染物在同一細胞周期的毒性效應，也有部分研究開展了同一污染物對處于不同周期細胞的毒性效應以及復合污染的細胞毒性效應，如Li等[51]運用ATR-FTIR研究了不同類型碳納米材料(C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管)的細胞毒性效應，結果表明：G0/G1期細胞的抗氧化酶的活性要高于S期，G0/G1期細胞對這3種碳納米材料的毒性效應更加敏感。Li等[4]將魚鰓細胞和MCF-7共同暴露在C60和苯并芘環境下，然后用顯微傅立葉變換紅外光譜法(Micro-FTIR)分析這2種細胞的生物結構信息。結果顯示低濃度C60可以促進苯并芘對細胞的氧化損傷，高濃度C60卻減弱這種影響效果；盡管低濃度C60可以促進苯并芘氧化損傷水平，但是若這2種物質共同處理細胞，卻減弱了任一種污染物單獨誘導的細胞氧化損傷水平。Llabjani等[52]運用ATR-FTIR研究多氯聯苯和多溴二苯醚對MCF-7的復合毒性作用時發現，通過相似調節機制作用的不同污染物可能產生抑制作用，而具有獨立作用機制的污染物可能增強該毒性作用。

3.1.2 植物毒性效應研究進展

紅外光譜在植物毒性效應方面的研究主要集中在浮萍和藻2種植物上。Hu等[14]使用FTIR結合多元統計的方法監測4種化學物質(Cu、Cd、阿特拉津和乙草胺)和4種金屬工業廢水對浮萍的蛋白質、脂質、DNA/RNA和碳水化合物等生物化學分子變化的影響情況，從而鑒定其對浮萍的毒性效應，結果表明以光譜信息為工具的毒性評價方法不但準確、可靠，而且能夠提供多效應終點的評價結果。Xin等[53]利用SR-FTIR研究了三氯生和卡馬西平對綠藻的毒性機制，結果顯示三氯生對綠藻的毒性要強于卡馬西平。三氯生通過抑制脂肪酸合成進而影響蛋白質合成，這種毒性作用在高濃度(100 μmol·L-1)下是不可逆轉的，但是隨著時間的延長它的濃度會減弱到0.391 μmol·L-1；卡馬西平可以產生疏水性的相互作用，影響磷脂雙層結構，并對特定的蛋白質起作用，使細胞膜失去功能。但是在延長暴露時間的同時，暴露在卡馬西平下的綠藻細胞會產生耐藥性。Dao等[54]利用ATR-FTIR研究了Pb對2種綠藻(小球藻和柵藻)的毒性效應，結果表明：在Pb暴露條件下，綠藻的多糖和脂質含量增加，但是蛋白質和磷酸分子含量減少，紅外光譜所表現的結果與光合參數與常規脂質測定的結果相吻合。

3.1.3 動物毒性效應研究進展

Li等[55]將斑馬魚分別暴露于C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管和單壁碳納米管21 d，ATR-FTIR結果顯示：高劑量的碳納米材料(CNPs)對斑馬魚的鰓和大腦的毒性更大，而低劑量的CNPs對性腺和肝臟的毒性更強；CNPs對斑馬魚的脂質、蛋白質和DNA/RNA產生顯著變化；腦和性腺對CNPs的響應更敏感，與對照組相比，長多壁碳納米管對大腦中脂質與蛋白質的比值沒有明顯的影響，而C60、短多壁碳納米管和單壁碳納米管會導致脂質與蛋白質的比率顯著升高，CNPs對雄性大腦的DNA/RNA光譜區域的影響比雌性更大。CNPs對大腦的干擾可能擾亂下丘腦-垂體-性腺軸，并進一步影響性腺；所以CNPs對斑馬魚具有一定的神經毒性和生殖毒性。Anusha等[56]將老鼠每天吸入蚊香8 h并持續30 d，結果顯示蚊香對老鼠的肝、腎、肺、心、腦等多種組織和功能有損傷情況。與對照組相比，吸入蚊香的老鼠肝臟、腎臟、肺和大腦中的生物大分子都發生了變化，主要表現在蛋白質和脂質相關振動峰降低。生物大分子改變程度在老鼠的肝臟和腎臟最顯著，接下來是肺和大腦。Palaniappan和Pramod[57]利用FTIR研究了二氧化鈦納米粒子及其塊狀材料對斑馬魚大腦生化成分的影響，研究結果顯示：納米二氧化鈦的毒性要強于其他塊狀材料；與對照組相比，暴露在二氧化鈦下的斑馬魚，其大腦組織中蛋白質、脂質和核酸等生化成分都發生了改變。大腦組織中脂質被氧化，導致羰基化物增加，因此羰基與-CH2的峰積分面積比升高，進一步證明大腦生化成分的改變主要是因為活性氧的過量產生。Prabha等[58]從印度泰米爾納德北部的池塘收集了南亞野鯪，然后以不同含量的黑藻為魚飼料，研究這種淡水魚的鉛毒性試驗。結果發現，對比鉛中毒和不同濃度黑藻處理過的魚骨樣品，魚骨中的蛋白質、碳水化合物和脂質的頻帶面積和峰強都有顯著變化。當南亞野鯪喂含20%黑藻的飼料，其魚骨的鉛含量顯著降低，說明黑藻具有對南亞野鯪骨組織中鉛誘導毒性的抗骨質疏松作用。

3.1.4 微生物毒性效應研究進展

Riding等[59]運用FTIR研究了碳納米材料對革蘭氏陰性菌的毒性效應，研究發現C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管和單壁碳納米管都導致細菌的脂質、酰胺II的DNA改變，改變程度隨納米粒子大小而不同，短多壁碳納米管比長多壁碳納米管毒性更強，C60毒性最小。相比于其他，而C60所表現出的光譜信息差異最顯著，且主要表現在蛋白質方面。Gupta等[60]利用紅外光譜法研究了重金屬Ni和Cr對大腸桿菌的毒性的相互作用，結果表明Ni(II)對大腸桿菌的親和性要強于Cr(VI)，因為它可能會侵入到大腸桿菌蛋白質的S層，所以它對大腸桿菌的毒性也要強于Cr。并且隨著Ni的不斷加入，會導致Cr對大腸桿菌的毒性增強，二者表現為協同作用。Ni會使大腸桿菌的脂質含量降低，在3 000～2 800 cm-1和～1 455 cm-1的頻帶峰面積減小，所以比較脂質譜帶面積可以去監測金屬毒性而導致的脂肪酸變化。Heys等[61]使用ATR-FTIR和SR-FTIR光譜研究碳納米材料(CBNs)對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的影響。結果顯示革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌在接觸CBNs時表現出不同的變化。革蘭氏陽性細菌對這些材料表現出更強的抵抗力，這可能是由于它有更堅固的細胞壁來維持其完整性，但是在接觸CBNs后革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的酰胺II都發生了變化。SR-FTIR因其高分辨率能夠提供反映納米毒性變化的詳細的、深入的信息，而ATR-FTIR光譜學則提供了被CBNs誘導所導致的細菌改變細節的合理概述。

上述研究已表明，紅外光譜技術(FTIR、ATR-FTIR和micro-FTIR)可以廣泛用于不同污染物對不同生物的毒性效應研究之中，這些技術有著各自的優缺點，如ATR-FTIR在這3種測定方法中是最靈敏的，但是該方法測定會破壞樣品，而且比較耗時；micro-FTIR靈敏度沒有ATR-FTIR高，但是可以不破壞樣品，并且可以進行面掃描。因此，在運用這些紅外技術研究污染物毒性效應時，需根據研究目的和樣品選擇合適的方法。

3.2 拉曼光譜在污染物毒性效應的研究進展

拉曼光譜技術是以拉曼散射效應為基礎，以光子為探針，具有實時在線分析、無損快速檢測等優秀特點的分子結構表征技術。近年來，拉曼光譜可以提供生物分子指紋圖譜，如蛋白質、DNA、脂類以及氨基酸、嘌呤等代謝中間產物的信息，因此能夠從分子水平上研究污染物的毒性效應。

3.2.1 常規拉曼光譜

Li等[62]利用拉曼光譜研究了C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管3種碳納米材料對MCF-7的毒性效應，結果表明：這3種納米材料均造成了胱氨酸和蛋白質比值的升高，其中短多壁碳納米管暴露造成的胱氨酸和蛋白質比值最高，胱氨酸和蛋白質比值增加與活性氧含量增加是成比例的，因此，也說明了短多壁碳納米管造成了活性氧含量升高的幅度最大。林凡佳等[63]使用拉曼光譜分析不同濃度的凋亡誘導劑(黃連素)對人肝癌細胞(HepG2)內吞Si納米粒子在520 cm-1的特征拉曼峰的平均信號強度，表征細胞內吞Si納米粒子的能力。結果表明，隨著黃連素濃度的增加，細胞對Si納米粒子的內吞能力減弱，原因是HepG2細胞凋亡過程中線粒體的活性不斷減弱，導致能量代謝受阻。Neugebauer等[64]采用拉曼光譜發現抗生素環丙沙星導致短小芽胞桿菌蛋白質峰減弱和核酸峰增強，從而認為環丙沙星能夠結合rRNA，進而抑制蛋白質的合成和核酸含量的增加。Li等[55]將斑馬魚分別與C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管和單壁碳納米管接觸21 d，然后用拉曼光譜分析了斑馬魚的大腦和性腺中的不飽和脂質含量(C=C和CH2的比例)，結果顯示經過處理的斑馬魚的脂質與對照組的斑馬魚差異很明顯，其中雄性斑馬魚中不飽和脂質含量要高于雌性。趙晶[65]利用拉曼光譜研究了4-壬基酚對大鼠睪丸組織的影響，結果表明：4-壬基酚暴露組與對照組之間有顯著性差異(P<0.001)，主要表現在脂質與蛋白質比率和不飽和脂肪水平等方面。

3.2.2 表面增強拉曼光譜

與常規拉曼相比，SERS可以使接近或吸附于金、鋁和銀等粗糙金屬表面或者納米結構(如等離子體磁性二氧化硅納米管[66])的分子的拉曼信號增強，其信號比常規拉曼散射增強106～1014倍[67]。SERS可以極大地提高拉曼信號強度、縮短采譜時間和淬滅熒光干擾，有效地解決常規拉曼所遇到的問題。Cui等[68]利用SERS研究了Ag對大腸桿菌的毒性，結果表明在Ag納米粒子的作用下大腸桿菌的蛋白質、次黃嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤核苷拉曼光譜帶會發生變化，其主要原因是Ag納米粒子影響嘌呤的代謝和蛋白質的合成過程，并且粒徑小的Ag納米粒子要比大的毒性更大。Zhang等[69]借助無納米毒性和高SERS活性納米金方法，研究了不同濃度納米ZnO(0、0.6、3、15、60、240、480 mg·L-1)作用于大腸桿菌不同時間(0.5、1.5、3、6、12、24 h)后細菌的特征生物變化和毒性動力學過程。結果表明，納米ZnO的毒性機制在于產生活性氧基團，導致損傷核酸和改變了膜的通透性，而細菌通過合成相關的防御蛋白來降低這種不利影響。納米Zn在0.5 h即可發揮毒性作用，且低劑量長期暴露能夠發揮與高劑量暴露相同的毒性作用。Walter等[5]通過使用SERS研究金屬納米粒子對鏈霉菌的毒性效應，結果顯示隨著Ni2+濃度的增加鏈霉菌中蛋白質(1 660和1 448 cm-1)的峰的相對強度增加，而DNA(1 574和1 480 cm-1)的峰強在減弱。El-Zahry等[70]研究了Ag納米粒子對細菌的毒性效應，再次證明Ag納米粒子的抗菌機制是影響嘌呤的代謝進而抑制蛋白質的合成。并且通過SERS譜圖分析發現，Ag納米粒子的粒徑和濃度對細菌的抗菌性能影響最大。Cui等[71]利用拉曼光譜研究重金屬As(V)和四環素對細菌的毒性效應，發現As(V)和四環素之間是交互抗性，As(V)在增強細菌耐藥性的同時阻止四環素起作用。Lu等[72]借助SERS和FTIR能夠預測細胞損傷類型和程度，然后深入了解大蒜萃取物和二烯丙基硫化物的抗菌機理。Li等[62]利用SERS分析了0.1 mg·L-1、0.01 mg·L-1和0.001 mg·L-1的C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管和單壁碳納米管對A549肺細胞的毒性效應，研究發現這些碳基納米離子會導致A549肺細胞的DNA甲基化水平增強，這也是首次發現納米粒子會改變細胞的甲基化水平。

拉曼光譜主要是針對非極性分子的檢測，而紅外光譜主要是針對極性分子的檢測，因此2種之間是互補的關系。此外，和紅外光譜相比，拉曼光譜在污染物毒性效應方面的研究較少，但是拉曼光譜所蘊含的信息更加豐富，應著重發展拉曼光譜在污染物毒性效應方面的應用。

4 研究展望(Research outlook)

(1)加強將紅外和拉曼光譜有機聯合應用，目前將兩者聯合用于污染物毒性效應的研究較少。因為許多在紅外光譜中較弱的波段是拉曼光譜中最強的波段，所以在污染物毒性效應研究中各有各的優勢，可以互補。通過有機地結合紅外和拉曼光譜的測定結果，能更好地反映污染物的毒性效應。

(2)拓展紅外和拉曼光譜污染物毒性效應研究的應用范圍。一方面是樣品類型的拓展，如在植物應用領域，目前基本上只運用在綠藻和浮萍等植物中，應進一步拓展到高等植物(農作物、蔬菜等)上；另一方面是目標污染物的拓展，如微塑料等新型污染物的研究。

(3)相對于紅外光譜而言，目前拉曼光譜的應用較少，特別是表面增強拉曼光譜的應用，拉曼光譜中所含有的生化特征要遠遠高于紅外光譜，因此，發展新的表面增強技術，特別是具有特異性指標的表面增強拉曼光譜技術，將是一個重要的研究方向。

(4)目前的研究大都側重于單一污染物的研究，但是環境中的污染大都以復合污染的形式存在，因此，應加強將生物光譜技術應用于復合污染的研究之中。