不同價態無機砷對羅非魚肝臟砷積累及GSH/GST解毒代謝的影響

裴佳，范文宏,2,*，董兆敏,2

1. 北京航空航天大學，空間與環境學院，北京 102206 2. 北京航空航天大學，醫工交叉北京市高精尖創新中心，北京 100191

水體中無機砷具有低濃度、高毒性、價態多變、難降解等特征，其會通過影響代謝酶、脂質過氧化、基因損傷、基因表達等方面對水生生態系統產生危害。水生生物可以通過水相吸收和食物相暴露2種途徑對砷進行富集[1]。現有研究已經表明一些主要的水生動物類群，比如捕食者(魚類、腹足類)和食底泥動物，攝食已經成為其富集砷的重要方式[2]。Cockell等[3-4]發現食物中較低濃度的砷(如100μg·g-1)就會對虹鱒魚幼魚(juvenile rainbow trout)的生長和營養鹽的吸收造成影響。Zhang等[5]發現無機砷食物相暴露黑鯛和花身鯻(seabreamAcanthopagrusschlegelii和gruntTeraponjarbua)28 d后肝臟中砷積累量增加，明顯高于肌肉和腸道中的積累量。并且食物相砷暴露能引起肝臟中谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)活性和谷胱甘肽(GSH)含量發生改變，從而影響生物體內的氧化應激反應。因此研究水體中砷通過攝食途徑進入生物體的積累和毒性效應對砷生態風險評估非常重要。

含砷食物進入生物體后，可以經消化系統吸收，隨血液分布到全身各組織和器官[6]。一系列研究表明無機砷暴露后肝臟是砷的主要負載器官，累積顯著高于其他組織[7-9]，同時肝臟是無機砷甲基化生成一甲基砷、二甲基砷，且進一步生成砷甜菜堿的主要場所[10]，因此在無機砷暴露情況下肝臟是重要的研究對象。砷的毒性機制研究主要集中在甲基化代謝、氧化應激、細胞毒性等方面[11-13]，然而這些機制都與生物體的氧化與抗氧化平衡有關。生物體內存在清除活性氧和自由基的抗氧化體系，包括酶系(如GST)和非酶系(如GSH)兩大類。有研究表明，金魚肝臟主要通過GSH和抗氧化酶的適應性變化來應對砷誘導的氧化應激[14]。GSH可直接與親電子劑反應或作為輔助因子參與反應，在砷解毒過程中發揮重要作用[15]。長期慢性砷暴露可引起機體GSH水平下降，而急性砷暴露則能夠引起GSH水平升高，表明生物體中GSH含量水平是決定其對砷敏感性的重要因素之一，但這種應激性反應的機制尚未完全闡明[16]。GST可通過催化降低砷的活性、加速其排泄，以達到解毒的效果，并且GST還能代謝小分子量的過氧化物，保護細胞不受活性氧自由基的損害[17-19]。另一方面污染物的脅迫可以影響生物體內GST基因的表達，從而改變其活性[20]。Zhang等[6]研究發現，牡蠣(oyster)暴露于無機砷一個月后，GST活性比空白組高。Ku等[21]的研究也表明當黃鯰魚暴露于污染物時，GST等酶活性發生變化。目前大量的研究都主要集中在砷暴露過程中GSH含量和GST活性的研究，但對生物體內砷的積累量與它們兩者之間的關系，以及GSH和GST在抗氧化反應過程中的具體作用關注較少。

羅非魚作為一種重要的淡水產品，是我國的主要食用魚種之一。羅非魚通過食物相攝取砷在砷污染區是十分常見的[22]。因此本研究以羅非魚為模式生物，通過食物相暴露，測定分析食物相暴露過程中羅非魚肝臟中砷的累積量、GSH含量和GST活性，以探討砷在體內的累積和GSH含量、GST活性的關系，從而為探究砷脅迫下體內抗氧化應激反應的過程和機理提供數據和理論參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 羅非魚暴露實驗

從北京市小湯山魚場購買體長(8.7～9.1 cm)、體重(20～22 g)的羅非魚(Oreochromisspp)魚苗，在實驗室內用羅非魚專用飼料(友誼恒遠科技有限公司)喂養，使其適應實驗室的環境，健康生長。飼養30 d饑餓48 h后，對它們進行為期32 d的食物相暴露。用NaAsO2和Na2HAsO4·7H2O固體(優級純，美國Sigma-Aldrich公司)配制As(III)和As(V)溶液，充分浸泡人工飼料，浸泡后放入真空干燥箱(DZF-6050，上海精宏實驗設備有限公司，上海)內60 ℃條件下烘干至恒重，使As(III)和As(V)標記人工飼料中砷含量分別為(752.0±12.8)μg·g-1、(800.5±15.3)μg·g-1。將制得的人工飼料儲存在4 ℃的冰箱中備用。羅非魚暴露在3個體積為120 L的魚缸中，每缸50條，用加熱棒加熱使水體溫度保持在25 ℃，光照和黑暗的時間為12 h∶12 h，每天按照羅非魚體重的3%投喂人工飼料，2 h后進行換水從而除去沒有被完全吃掉的食物，在第2天的早上清除羅非魚的排泄物。在暴露后的0、2、4、6、8、10、13、16、20、24、28和32 d，從各處理組中隨機取6只羅非魚，于低溫下解剖取出肝臟，用于后續的砷積累量、GSH含量以及GST活性測定。

1.2 羅非魚肝臟內砷積累量的測定

取適量(0.5～1.0 g)上述羅非魚肝臟，利用冷凍干燥機(Christ ALPHA 1-2 LD plus，上海亙先實業有限公司，德國)干燥10 h至恒重后，稱量干重0.05～0.1 g并轉移至15 mL的離心管中，依次加入2 mL濃硝酸和0.5 mL雙氧水，在120 ℃的條件下消解至澄清透明，冷卻至室溫后，使用超純水定容至5 mL。用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，Thermo iCAP Q，美國)測定消解液中砷的濃度。測定過程中采用BCR-627金槍魚標準物作為質量控制樣品，其中含砷總量為(4.9±0.3)μg·g-1，回收率為94%～103%。

1.3 羅非魚肝臟中GSH含量和GST活性的測定

稱量濕重為0.01 g的羅非魚肝臟瀝干水分放入離心管中，向離心管中加入1.0 mL預冷的勻漿液(0.25 mo1·L-1蔗糖、0.l mo1·L-1Tris-HCl、pH=8.6緩沖液)，在冰浴中用超聲波勻漿破碎儀(新芝生物科技公司，SCIENTZ-II D)進行破碎，高速冷凍離心機(CF16RX，HITACHI公司，日本)0 ℃、16 000 g離心20 min后，取上清液0.2 mL。采用南京建成生物工程研究所市售的GSH測試盒，根據GSH巰基可以與二硫代二硝基苯甲酸發生反應，生成一種黃色的化合物，從而通過測定該物質在420 nm處的吸光度，并與標準物質比對，得到樣品溶液中GSH的含量，GSH的含量以單位質量蛋白(mg prot)的GSH質量(mg)表示。用GST測試盒，根據GSH與1-氯-2,4-二硝基苯的結合反應，在一定的反應時間內，酶的活性與反應前后底物的濃度變化顯著相關，從而通過測定412 nm波長下GSH的濃度來表示GST酶的活性，GST的活力以單位質量蛋白(mg prot)的活力單位(U)表示。

1.4 數據處理

實驗數據均以平均值±標準差(Mean ± SD)表示，實驗數據利用SPSS 13.0軟件進行統計分析，利用單因素方差分析(One-way AVONA)和Duncan檢驗法在P=0.05的置信水平對組間數據進行差異顯著性分析，并用回歸分析方法作相關性分析。

2 結果(Results)

2.1 羅非魚肝臟中砷的含量

As(III)和As(V)食物相暴露32 d過程中羅非魚肝臟中砷的積累量如圖1所示。經As(III)和As(V)食物相暴露后，肝臟中的總砷含量均顯著增加，與空白組有顯著性差異。As(III)食物相暴露情況下，砷含量在2 d內顯著增加達到(11.15±0.51)μg·g-1，而在隨后的30 d暴露期內，其積累量無顯著性差異，趨于穩定。As(V)食物相暴露的條件下，隨著時間的增長，羅非魚肝臟中砷含量逐漸增加，在20 d時達到最大值(26.2±0.48)μg·g-1，顯著高于As(III)的最高累積量。24 d時顯著下降為(14.39±3.18)μg·g-1，而后砷積累量無顯著性差異。在為期32 d的As(III)和As(V)食物相暴露過程中，肝臟中的積累量表現出了不同的趨勢，As(III)暴露情況下積累量快速達到平衡。在暴露初期，As(III)食物相暴露積累量高于As(V)，后期As(V)高于As(III)。

圖1 As(III)和As(V)食物相暴露32 d中羅非魚肝臟中砷的積累量注：圖中不同字母代表組間具有顯著差異。Fig. 1 Bioaccumulation of total arsenic in liver in different exposure time of tilapia during 32 d exposure to As(III) and As(V)Note: different letters represent significant differences between groups.

2.2 肝臟中GSH含量及GST活性

32 d無機砷食物相暴露過程中羅非魚肝臟中GSH含量及GST活性如表1所示。GSH背景含量約為(25.44±3.46) mg·g-1prot。經As(III)和As(V)暴露0～2 d后GSH含量分別增加為(33.77±3.35) mg·g-1prot和(38.77±3.11) mg·g-1prot，表明急性砷暴露能引起肝臟GSH含量的顯著升高。As(III)食物相暴露2～6 d后GSH含量降低到(21.22±2.03) mg·g-1prot，下降了37.1%；6 d后含量又逐漸升高，在13 d含量達到最大值(37.41±3.25) mg·g-1prot，13 d后GSH含量均低于空白組。As(V)食物相暴露2～4 d后GSH含量降低，4～16 d后GSH含量增加且16 d達到最大值(41.02±4.67) mg·g-1prot，16 d后GSH含量均低于空白組。總體而言，As(III)和As(V)食物相暴露過程中，GSH含量呈現了先增加后降低最后趨近穩定的變化趨勢，表明在短期暴露內GSH含量增加用來拮抗砷的毒性，隨著時間的增加，GSH被大量消耗，含量降低。

空白組GST活性為(114.94±14.54) U·mg-1prot。As(III)食物相暴露0～6 d后GST被誘導合成，其活性均大于空白組，6～8 d時GST活性降低，8 d后活性增加，32 d達到最大值(190.77±20.49) U·mg-1prot。As(V)食物相暴露0～8 d后GST被大量誘導合成，8～20 d后GST合成被抑制，20 d后活性增加，在32 d達到最大值(195.6±25.15) U·mg-1prot。無機砷食物相暴露過程中，GST活性呈現先增加后降低又增加的趨勢，表明在急性暴露過程中，GST被誘導合成來催化GSH與砷的結合，隨著暴露時間的增加，酶的活性受到了抑制，在暴露的后期生物體通過自身調節等的作用，GST活性增大。

2.3 砷累積量和肝臟中GSH含量及GST活性的關系

32 d的As(III)食物相暴露過程中，隨著羅非魚肝臟中砷積累量的增加，As(III)暴露組GSH含量升高，各時間點肝臟中砷的積累量與GSH含量之間呈正相關(y=1.492x+9.177)，如圖2(A)所示。而32 d的As(V)食物相暴露過程中，各時間點肝臟中砷的積累量與GSH含量之間沒有相關關系，如圖2(B)所示，原因可能是As(V)暴露時砷的累積量在暴露初期一直在緩慢上升，而對應的GSH含量卻很快達到了高點，隨后緩慢下降。

表1 暴露過程中羅非魚肝臟中GSH含量和GST活性Table 1 The GSH content and GST activity in tilapia liver during exposure

注：GSH表示谷胱甘肽；GST表示谷胱甘肽巰基轉移酶；*與空白組比較有顯著性差異。

Note: GSH represents glutathione; GST represents glutathione S-transferase; * represents significant differences compared with blank group.

圖2 三價砷(A)和五價砷(B)食物相暴露各時間點肝臟中砷的積累量與GSH含量的相關性Fig. 2 The relationship between arsenic accumulation and GSH content during 32 d As(III) exposure (A) and As(V) exposure (B)

圖3 三價砷食物相暴露各時間點肝臟中砷的積累量與GST活性的相關性(A)；五價砷食物相暴露各時間點砷的積累量與GST滯后一個時間點的活性相關性(B)Fig. 3 The relationship between arsenic accumulation and GST activity in same time point during 32 d As(III) exposure (A); the correlation between the arsenic accumulation and GST activity in next time point during 32 d As(V) exposure (B)

As(III)食物相暴露32 d內各時間點肝臟中砷的積累量與GST活性呈顯著負相關，如圖3(A)所示。而對于As(V)食物相暴露，32 d內各時間點肝臟中GST活性與積累量具有滯后一個時間點的負相關性，如圖3(B)所示。這兩者均表明GST對砷在生物體內的積累轉化和解毒有著重要的作用。

3 討論(Discussion)

3.1 無機砷在肝臟中積累機制

3.2 肝臟中無機砷對GSH含量/GST活性的影響機制探究

從表1可以看出，無機砷暴露可以改變肝臟中GSH含量，從而拮抗無機砷對生物體的毒性作用，且隨著積累量的增加，暴露于As(III)的羅非魚肝臟中GSH含量增加。有研究發現1 000μg·L-1As(III)暴露48 h后，鯉魚肝臟中GSH的含量顯著增加[27]。另有研究顯示無機砷急性暴露后，隨著染毒時間的延長，小鼠肝組織內GSH的含量整體呈先上升后下降的趨勢，并在染毒12 h達到最高值[28]。這些研究結果表明，砷暴露引起的機體GSH含量變化是一個復雜的過程。當生物體受到砷的脅迫時，GSH中的巰基直接與親電子類物質反應，清除砷暴露誘導產生的氧化應激，同時與生物體內積累的砷直接反應，保護含有巰基的酶或者蛋白類物質，以拮抗無機砷暴露對機體的損傷[29]。Wang等[30]以人肝細胞為研究對象，發現NaAsO2(0～30 μmol·L-1)處理24 h后，胞內GSH含量隨染毒劑量增加而逐漸升高，并呈現明顯的劑量-反應關系。李富君等[31]的研究表明高濃度砷暴露后血液中GSH含量顯著增加，且不同劑量、不同染毒時間引起血液及組織中GSH含量變化不同。這表明As(III)在機體代謝過程中消耗了大量的GSH，同時為抵抗As(III)產生的毒性，機體又不斷產生GSH，故隨著肝臟中砷積累量的增加GSH含量也增加。對于As(V)，其進入生物體后首先被還原為As(III)，然后再進一步甲基化[6,32-33]。在As(V)還原成As(III)過程中GSH能作為重要的還原劑被大量消耗，這可能是造成砷積累量與GSH之間沒有明顯關系的原因，具體的原因還需要進一步探究。

GST主要催化各種親電物質與GSH的巰基結合，變成親水物質，進而排出體外。由圖3可以發現GST活性與肝臟中砷的積累量呈顯著的負相關關系。Sinha等[27]發現亞砷酸鈉的暴露顯著降低了小鼠肝臟中GST的活力。姚琴[34]研究發現中、低濃度As(III)暴露可提高GST活性，但隨著As(III)濃度的增加，GST活性降低。這表明隨著As(III)染毒劑量和積累量的增加，一方面生物體內脂質過氧化損傷加重，超過其限度，對GST活性表現出抑制作用；另一方面，GST作為一種球狀二聚體蛋白，As(III)可與酶蛋白分子上的巰基或羥基結合形成穩定的絡合物或環狀化合物，當生物體內砷的積累量超過一定量時，導致GST活性降低甚至失活，故As(III)暴露隨著肝臟中積累量的增加，GST活性降低。一系列研究表明As(V)在生物體內的代謝過程為：首先轉化成As(III)，然后再進行甲基化，生成一甲基砷、二甲基砷，再與基團結合形成砷甜菜堿、砷膽堿等物質，肝臟是As(V)代謝的重要場所[33,35]。Zhang等[36]的研究表明當褐籃子魚暴露于含1 500μg·g-1As(V)的人工飼料時，肝臟中As(III)的比例與As(V)相當。這表明在肝臟中As(V)可大量轉化為As(III)，As(III)可以直接作用于酶活系統，更易與生物體內GSH、酶類如GST以及組織蛋白中的巰基及羥基結合，故酶GST活性下降。As(V)不能與酶系統直接作用且As(V)代謝中形態的轉化可能是導致As(V)食物相暴露中GST活性與積累量的關系滯后一個時間點呈負相關的原因。

羅非魚受到無機砷暴露情景下，肝臟中GST活性和GSH含量發生改變，從而抵抗無機砷對魚體的毒性，且As(III)和As(V)對羅非魚GSH/GST的不同影響與其在羅非魚體內的積累量有關。此研究為水生生物在砷暴露環境中機體的解毒機制提供了一定的數據基礎，不同形態無機砷對水生生物的致毒及代謝機制需進一步深入研究。