羥基多溴聯苯醚(OH-PBDEs)小鼠肝臟微粒體體外代謝及對雌激素代謝的影響研究

陳玫宏，徐懷洲，宋寧慧，張芹，張圣虎,*，李江

1. 生態環境部南京環境科學研究所，南京 210042 2. 貴州大學資源與環境工程學院，貴陽 550025

羥基多溴聯苯醚(OH-PBDEs)作為一類具有內分泌干擾性質的酚類化合物已經引起了人們的廣泛關注[1-3]。與母體多溴聯苯醚(PBDEs)相比，具有更大的生物毒性效應[4-5]，目前在環境介質[6-8]、生物體[9-11]甚至人體[12-14]中均有檢出，表明OH-PBDEs具有一定的持久性。目前有研究表明，OH-PBDEs可以在生物體內通過生物酶催化氧化進一步形成一相代謝產物，代謝速率受溴原子數量及羥基、溴原子和醚鍵三者之間的位置等因素的影響[15-19]。

由于生物體內雌激素的合成和代謝受多種因素的調節，外源性雌激素可能通過影響這些調節發揮其雌激素活性效應[20-22]。目前研究表明OH-PBDEs在生物體內能夠影響磺基轉移酶的生物活性[23-25]。細胞色素P450酶作為生物體內重要代謝酶系，是維持哺乳動物體內適當17β-雌二醇(E2)水平的主要因素，Lai和Cai[26]發現OH-PBDEs對E2的代謝能夠產生非競爭性抑制作用。

因此，本研究用小鼠肝微粒體對4種OH-PBDEs(5'-OH-BDE-99、6'-OH-BDE-99、6-OH-BDE-99和6-OH-BDE-137)進行體外代謝研究，并考察OH-PBDEs對雌激素包括雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、17α-炔雌醇(EE2)等代謝的影響，有助于更加全面的評價OH-PBDEs在生物體的代謝行為和毒性效應。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

AG-285電子天平(Mettle公司，瑞士)；Biofuge stratos高速冷凍離心機(Heraeus公司，德國)；Avanti J-30I超高速離心機(Beckman Coulter公司，美國)；Tecan Infinite 200酶標儀(Tecan公司)；恒溫振蕩培養箱(INNOVA 43R，NBS公司)；UVmini-1240紫外分光光度計(Kyoto公司，日本)；超高效液相色譜-串聯質譜儀(LC-Agilent Technologies 1290 Infinity, MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美國)。

圖1 羥基多溴聯苯醚(OH-PBDEs)和雌激素的結構圖注： 5'-OH-BDE-99為5’-羥基-2,2',4,4',5-五溴聯苯醚，6'-OH-BDE-99為6’-羥基-2,2',4,4',5-五溴聯苯醚，6-OH-BDE-99為6-羥基-2,2',3,4,4'-五溴聯苯醚，6-OH-BDE-137為6-羥基-2,2',3,4,4',5-六溴聯苯醚；E1為雌酮，E2為17β-雌二醇，E3為雌三醇，EE2為17α-炔雌醇。Fig. 1 Constructions of hydroxyl polybrominated diphenyl ethers (OH-PBDEs) and estrogensNote: 5'-OH-BDE-99 (5'-Hydroxy-2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether), 6'-OH-BDE-99 (6'-Hydroxy-2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether), 6-OH-BDE-99 (6-Hydroxy-2,2',3,4,4'-pentabromodiphenyl ether), 6-OH-BDE-137 (6-Hydroxy-2,2',3,4,4',5-hexabromodiphenyl ether); E1 (Estrone), E2 (17β-Estradiol), E3 (Estriol), EE2 (17α-Ethynylestradiol).

4種OH-PBDEs和4種雌激素(圖1)：5'-羥基-2,2',4,4',5-五溴聯苯醚(5'-OH-BDE-99)、6'-羥基-2,2',4,4',5-五溴聯苯醚(6'-OH-BDE-99)、6-羥基-2,2',3,4,4'-五溴聯苯醚(6-OH-BDE-99)、6-羥基-2,2',3,4,4',5-六溴聯苯醚(6-OH-BDE-137)、雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、17α-炔雌醇(EE2)購于百靈威科技有限公司(J&K公司)。

三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(Na2EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍G250、7-乙氧基試鹵靈、試鹵靈、甘氨酸、7-乙氧基香豆素、7-羥基香豆素、鹽酸苯胺、4-氨基苯酚均購于J&K公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)購自Sigma Aldrich公司；甲醇和乙腈為色譜純，購自德國Merck公司；氨水(色譜純)、二甲基亞砜(DMSO，藥檢專用)、氯化鉀和氫氧化鈉(分析純)均購于國藥集團藥業股份有限公司。

1.2 肝微粒體的制備

無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級ICR小白鼠(約6周齡)購自上海杰思捷實驗動物有限公司。通過頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出肝臟，在冰浴中用冰冷的生理鹽水(0.9%)沖洗，濾紙拭干后稱重，剪碎后加入由20%甘油、0.15 mol·L-1KCl、1 mmol·L-1Na2EDTA、0.1 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)、0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)配制而成的緩沖液(m(肝臟)∶V(緩沖液)=1∶3)，勻漿后以9 000 g(4 ℃)離心20 min。將所得上清液在105 000 g(4 ℃)下進一步離心30 min，棄去上清液，淡紅色沉淀物即為肝臟微粒體。按單位肝臟重量(g)加0.5 mL重懸緩沖液(20%甘油、1 mmol·L-1Na2EDTA、0.1 mmol·L-1DTT，以0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)配制。制成勻漿，分裝后儲存于液氮中備用。用Bradford法測定微粒體蛋白質濃度，以牛血清蛋白作為標準蛋白[27]，以上步驟均在冰浴中進行。

1.3 酶活性測定方法

乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)活性的測定方法[16,18]：反應體系包括1 mg·mL-1牛血清蛋白(BSA)、1 mmol·L-17-乙氧基香豆素、微粒體樣品液，Tris-HCl緩沖液用于維持體系的pH值，整個反應體系總體積為1 mL。37 ℃預熱5 min后加入NADPH開啟反應，反應10 min后，添加三氯乙酸(15%)終止反應。加入2 mL三氯甲烷萃取反應產物，渦旋2 min后于3 000 g下離心5 min；隨后，取1 mL有機相加入5 mL 0.6 mol·L-1NaOH-甘氨酸緩沖液(pH 10.4)，渦旋萃取，用酶標儀在激發波長370 nm和發射波長450 nm處檢測7-羥基香豆素的吸光度值。酶活性最終用7-羥基香豆素的生成量表示，單位為pmol·min-1·mg-1。

1.4 OH-PBDE對微粒體活性影響

通過在NADPH存在下將小鼠肝臟微粒體與OH-PBDE一起孵育，分別考察不同濃度的OH-PBDE對小鼠肝臟微粒體CYP450的ECOD活性的影響。設定OH-PBDE在代謝體系中濃度為1.5、3、6、15、30μmol·L-1，于37 ℃條件下代謝2 h，終止反應后，測定ECOD的活性，對照組不添加OH-PBDE。

1.5 體外代謝實驗

1.5.1 OH-PBDEs的體外代謝

代謝反應體系體積為2 mL(pH=7.4)，包含0.1 mol·L-1Tris-HCl、3μmol·L-1OH-PBDE、1 mg·mL-1微粒體，OH-PBDEs用DMSO助溶(反應體系中DMSO比例為1%)。將反應體系在37 ℃(120 r·min-1)恒溫震蕩器中預孵育5 min，然后加入輔酶NADPH啟動反應。NADPH的最終濃度為0.8 mg·mL-1，對照組不含輔酶。孵育2 h后，加入2 mL冰乙腈終止反應，放入-20 ℃冰箱20 min后，取上清液過0.22μm有機濾膜，待HPLC-MS/MS測定目標物的濃度。4種OH-PBDEs單獨進行體外代謝實驗，每組設置3個平行，一個對照組，并根據代謝反應結束時OH-PBDEs的濃度與零時刻濃度比值計算代謝率。

1.5.2 OH-PBDEs對雌激素體外代謝影響

分別將4種OH-PBDEs添加到含2.7μmol·L-1雌激素的代謝體系中進行代謝影響研究。代謝反應體系體積為2 mL，包含0.1 mol·L-1Tris-HCl、1.5～6(1.5、3、6)μmol·L-1OH-PBDE、2.7μmol·L-1雌激素(E1、E2、E3、EE2)、1 mg·mL-1微粒體，加入輔酶NADPH啟動反應，37 ℃下分別振蕩培養2 h，每組設置3組平行，對照組不含OH-PBDEs。代謝反應結束時加入2 mL冰乙腈，放入-20 ℃冰箱20 min后，取上清液過0.22μm有機濾膜后測定雌激素的含量，并根據代謝反應結束時雌激素的含量與零時刻含量比值計算代謝率。

1.6 儀器分析1.6.1 OH-PBDEs的測定

樣品測定采用高效液相色譜串聯質譜(HPLC-MS/MS)：質譜條件為電噴霧離子源(ESI-)，多反應離子監測(MRM)，負離子模式，離子源溫度500 ℃，離子噴霧電壓4 500 V，氣簾氣壓力206 851.8 Pa，噴霧氣壓力241 327.1 Pa，輔助加熱氣壓力275 802.4 Pa；色譜條件為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm × 2.1 mm, 3.5μm)，OH-PBDEs測定的流動相為0.2% (V/V)氨水(A)和乙腈(B)，A與B的比例為3:7(V/V)，柱溫40 ℃，進樣體積5μL，外標法定量。具體參數見表1。4種OH-PBDEs均在1～100μg·L-1范圍內線性相關，相關系數(r2)為0.9789，定量限(LOQ)范圍為0.01～1.03μg·L-1，回收率范圍為65%～116%。

1.6.2 雌激素及其產物的測定

4種雌激素及產物2-羥基雌二醇(2-OH-E2)采用高效液相色譜串聯質譜(HPLC-MS/MS)進行檢測分析。質譜條件為電噴霧離子源(ESI-)，多反應離子監測(MRM)，負離子模式，離子源溫度400 ℃，離子噴霧電壓4 500 V，氣簾氣壓力206 851.8 Pa，噴霧氣壓力241 327.1 Pa，輔助加熱氣壓力275 802.4 Pa；色譜條件為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm × 2.1 mm，3.5μm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，A與B的比例為3:7(V/V)，柱溫40 ℃，進樣體積5μL，外標法定量，其他具體參數見表2。

1.7 數據處理

本文所有結果均采用平均值±標準偏差(mean±SD)表示。采用SPSS19.0和獨立樣本T檢驗(單因素方差分析，Dunnett’s T3(3))，對各處理組與對照組數據進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著(*)。

表1 4種OH-PBDEs的質譜條件Table 1 Mass spectrometric conditions of four OH-PBDEs

注：*為定量離子。

Note: * represents quantitative ions.

表2 4種雌激素及產物的質譜條件Table 2 Mass spectrometric conditions of four estrogens and products

注：*定量離子; 2-OH-E2表示2-羥基雌二醇。

Note: * represents quantitative ions; 2-OH-E2 stands for 2-hydroxyestradiol.

圖2 不同濃度的OH-PBDEs對7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)活性的影響注：CK表示未添加OH-PBDEs時，孵育2 h后ECOD活性； *表示與對照相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Effect of OH-PBDEs at different concentrations on the 7-ethoxycoumarin-O-deethylase (ECOD) activityNote: CK indicates ECOD activity after 2 h incubation without OH-PBDEs; * indicates significant difference (P<0.05), compared with CK.

圖3 OH-PBDEs與孵育時間的關系Fig. 3 Concentrations of OH-PBDEs as a function of incubation time

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 OH-PBDEs對ECOD活性的影響

由于ECOD可以表征CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B1、CYP2B6、CYP2E1等多種CYP450酶亞系的活性，因此ECOD活性一般可以作為表征CYP450總活性的指標。

在未添加OH-PBDEs時，微粒體孵育2 h后ECOD活性為(2 500±43) pmol·min-1·mg-1protein。不同OH-PBDEs濃度下ECOD活性結果如圖2所示，隨著反應體系中OH-PBDEs濃度的增加，5'-OH-BDE-99在低濃度(1.5μmol·L-1)下顯著促進ECOD活性(P<0.05)，其余濃度條件下與對照相比不存在顯著性差異；6-OH-BDE-99隨濃度的增加降低了ECOD活性，但是與對照相比不存在顯著性差異；6-OH-BDE-137在低濃度(1.5μmol·L-1)下對ECOD活性無顯著影響，但是隨著濃度的增加顯著促進ECOD活性，與對照相比存在顯著性差異(P<0.05)；6'-OH-BDE-99隨濃度的增加，對ECOD活性的影響不明顯。由此可見，4種OH-PBDEs對微粒體ECOD活性存在不同作用。

2.2 OH-PBDEs的體外代謝

圖3為4種OH-PBDEs的代謝率隨孵育時間的變化圖。由圖3可以看出，隨孵育時間的增加，4種OH-PBDEs的代謝率逐漸增大，在100 min左右達到最高，反應結束時基本達到平衡位置，其中6-OH-BDE-99代謝率最大，為85.9%，其他3種OH-PBDEs(5’-OH-BDE-99、6’-OH-BDE-99、6-OH-BDE-137)的代謝率分別為46.0%、64.3%、53.9%。

研究表明，溴原子數量會影響OH-PBDEs的代謝，Li等[16]用豬肝微粒體體外代謝3種OH-PBDEs (3’-OH-BDE-7、4’-OH-BDE-17和3-OH-BDE-47)，發現代謝率隨溴原子數量的增加而降低。Lai和Cai[26]用大鼠肝微粒體體外代謝11種OH-PBDEs，發現溴原子含量較多的6-OH-BDE-137代謝率最小，這與本研究結論一致(6-OH-BDE-137<6-OH-BDE-99)。此外，對于溴原子數量相同的3種五溴OH-PBDEs，醚鍵與羥基(OH)官能團及溴原子互為鄰位時代謝率最高，表明醚鍵、OH官能團和溴原子的相對位置對代謝有重要影響，這與Lai和Cai[26]以及本實驗室[18]前期研究結論一致。

2.3 OH-PBDEs對雌激素體外代謝的影響

4種不同濃度OH-PBDEs對雌激素代謝影響見圖4。結果表明，除EE2外(代謝率91.0%)，4種OH-PBDEs不同濃度下對其余3種雌激素(E1、E2和E3)代謝具有不同影響。與未添加OH-PBDEs的空白對照組相比(52.3%)，5’-OH-BDE-99在實驗設置的低濃度時對E1代謝無影響，但是隨著實驗添加濃度的增加，對E1代謝表現出顯著的抑制作用(P<0.05)；6’-OH-BDE-99和6-OH-BDE-99在實驗設置的低濃度時具有顯著的促進作用(P<0.05)，但隨著實驗添加濃度的增加，對E1代謝的促進作用逐漸降低；6-OH-BDE-137在實驗設置濃度下對E1代謝無影響。

E2與E1的代謝率接近，為47.1%。與未添加OH-PBDEs的空白對照組相比，5’-OH-BDE-99隨實驗添加濃度的增加略有降低，但是無顯著性影響；其余3種OH-PBDEs在實驗設置的低濃度時對E2代謝具有顯著的促進作用(P<0.05)，但隨著實驗添加濃度的增加，6’-OH-BDE-99對E2代謝的促進作用逐漸降低，并在實驗設置的高濃度時表現出顯著的抑制作用(P<0.05)，而6-OH-BDE-99和6-OH-BDE-137隨著實驗添加濃度的增加促進作用略有降低，但仍表現出顯著的促進作用(P<0.05)。目前，OH-PBDEs對雌激素代謝的影響的研究報道較少，Lai和Cai[26]研究了BDE 47、6-CH3O-BDE-47和2種OH-PBDEs(2’-OH-BDE-28和3’-OH-BDE-100)在濃度范圍0.9～412.0μmol·L-1內對E2代謝的影響，結果發現相對母體BDE 47和甲氧基6-CH3O-BDE-47，2種OH-PBDEs更能夠顯著抑制E2的代謝，而且對E2代謝表現為非競爭性抑制。與本研究結果不同，這可能與OH-PBDEs的結構以及設置濃度有關，對生物體內E2代謝的差異可能源于OH-PBDEs對本身代謝體系酶活性的影響所致，有待于進一步研究。

E3的代謝率相對較低，僅為16.9%，這可能是由于E3作為E2的代謝物，生物利用性相對較低[28]。與未添加OH-PBDEs的空白對照組相比，5’-OH-BDE-99、6’-OH-BDE-99和6-OH-BDE-99對雌激素代謝影響表現出相似的趨勢，在實驗設置的低濃度時表現為促進作用，且隨著OH-PBDEs濃度的增加，促進作用逐漸增加，在實驗設置的高濃度時具有顯著的促進作用(P<0.05)；6-OH-BDE-137與上述3種OH-PBDEs對E3代謝的影響略有不同，在實驗設置的低濃度時對E3代謝具有顯著的促進作用(P<0.05)，但隨著實驗添加濃度的增加，6’-OH-BDE-137對E3代謝的促進作用逐漸降低。

圖4 不同濃度OH-PBDEs對雌激素代謝的影響注：CK表示未添加OH-PBDEs時，孵育2 h后雌激素的代謝率；*表示與對照相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 4 Effects of different concentrations of OH-PBDEs on metabolism of estrogensNote: CK indicates metabolic rate of estrogen after 2 h incubation without OH-PBDEs; * indicates significant difference (P<0.05), compared with CK.

由于不同的雌激素是由不同的酶催化[25]，Kester等[24]報道了OH-PBDEs對E2磺基轉移酶的抑制作用，導致E2硫酸化降低和內源性雌激素的生物利用度增加。因此不同結構和濃度的OH-PBDEs對E1、E2、E3代謝產生的不同效應，在一定程度上說明外源性物質可能對代謝雌激素的生物酶的活性位點產生作用，進而影響其代謝，但是具體如何影響將進一步研究。

雌激素的代謝途徑較為復雜，最常見的有2、6α、6β、15α、16α羥基化，17β羥基脫氫氧化以及3-羥基硫酸酯化[29]。為了進一步研究OH-PBDEs對雌激素代謝的影響，以E2為代表定量表征其代謝產物生成量，由于2-OH-E2是E2在I相酶中的主要代謝產物之一，能夠評估外源性化合物對E2代謝的抑制[30]，因此，本研究利用外標法定量測定了E2代謝產物2-OH-E2的生成量，結果見表3。與未添加OH-PBDEs的空白對照相比，5’-OH-BDE-99能夠抑制2-OH-E2的生成量，但是隨著實驗添加濃度的增加，抑制作用無明顯差異；其余3種OH-PBDEs在實驗設置的低濃度時對2-OH-E2的生成量具有促進作用，但隨著實驗添加濃度的增加，6’-OH-BDE-99和6-OH-BDE-137抑制了2-OH-E2的生成量，且6-OH-BDE-137抑制能力更強，而6-OH-BDE-99隨著實驗添加濃度的增加促進作用反而增加，這表明OH-PBDEs的不同暴露水平對2-OH-E2的生成量存在差異，也間接表明對E2代謝途徑的影響不同，有待于進一步研究。