丙烯腈誘導大鼠脾的氧化應激和免疫系統響應

魏琳顏，高霞，魏倩，張瑞萍，石影，鄭愛，薛紅麗

蘭州大學公共衛生學院，蘭州 730000

丙烯腈(acrylonitrile, ACN)是一種無色、苦杏仁味、易揮發的有機合成原料，在合成樹脂、纖維、橡膠等高分子材料中被廣泛使用[1]。ACN能通過消化道、呼吸道和皮膚等多種途徑進入機體，引起多個器官的病理改變。單細胞凝膠電泳結果顯示25 mg·kg-1ACN亞慢性染毒可使大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷，表現為淋巴細胞DNA含量及尾長顯著增加[2]。Li等[3]發現ACN可以通過破壞脂筏，引起B細胞淋巴瘤-10蛋白和脂筏分離，并通過抑制Ras-Raf-ERK通路引起免疫毒性。核轉錄因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)是細胞核內重要的轉錄調節因子，不僅參與機體免疫、炎癥、組織損傷修復和胚胎發育等過程，還可調節凋亡相關基因的表達[4]。NF-κB通常與其抑制劑IκB(inhibitor of nuclear factor kappa-B)結合，活性氧(reactive oxygen species, ROS)過量產生時激活IκB激酶復合物IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)，進而降解IκB蛋白[5]，然后NF-κB被游離出來而激活，激活后的NF-κB轉移至細胞核發揮其生物活性作用[6]，其激活程度也可以被抗氧化劑所調節[7]。NF-κB還受IκB的負反饋調節，因此NF-κB被活化后可以上調IκB的表達，這些新生成的IκB，一方面可與游離的NF-κB結合，重新使NF-κB的活性被抑制；另一方面，也可進入細胞核向外輸出NF-κB的功能。研究發現，ROS激活的NF-κB信號通路能被N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)特異性地抑制[8]。脾是人體最大的外周免疫器官，脾臟在機體免疫、抗感染、血液濾過等方面起著重要作用。目前關于ACN對其他臟器毒性和機制的研究較多，而脾的研究資料較為缺乏。故本實驗通過對大鼠亞急性染毒ACN，觀察大鼠脾損傷的一般毒性表現，測定炎性因子，檢測NF-κB(p65)、IκB、p-IκB蛋白和基因表達水平變化，探討氧化應激激活的NF-κB信號通路與ACN致大鼠脾損傷的關系，為進一步研究ACN的脾臟毒性機制提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑

ACN購于天津凱信(純度>99%)，NAC購于美國Amersco公司。p65兔抗大鼠一抗，IκB兔抗大鼠一抗，p-IκB兔抗大鼠一抗，HRP標記山羊抗鼠二抗均購于美國CST公司，GAPDH一抗購于美國SAB公司，HRP標記山羊抗兔二抗購于美國SAB公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)測試盒均購于南京建成生物工程研究所，BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒購于美國Thermo公司。白介素6(IL-6)、白介素1-β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒均購于Elabscience公司。

1.2 實驗動物及分組

SPF級健康成年SD雄性大鼠60只，體重180～220 g，購于甘肅中醫藥大學SPF級實驗動物中心(實驗動物質量合格證編號SCXK(甘)2015-0002)。隨機分為5組，每組12只，飼養于蘭州大學公共衛生學院實驗中心(實驗設施合格證編號SYXK(甘)2015-0005)，自由進食及飲水，適應性飼養1周后，以11.5(低劑量組)、23.0(中劑量組)、46.0(高劑量組) mg·kg-1ACN、46.0 mg·kg-1ACN + 300 mg·kg-1NAC(NAC干預組)灌胃，NAC干預組NAC灌胃30 min后再灌ACN，對照組大鼠給予玉米油，1次/天，6天/周。染毒劑量主要依據本團隊前期研究結果和Abdel Naim[9]的研究設定，連續灌胃4周后處死大鼠。

1.3 脾臟器系數測定

末次染毒結束后，次日稱重。乙醚麻醉處死大鼠，分離大鼠脾并置于0.9%生理鹽水中，沖洗干凈，濾紙拭干后稱重并記錄。

1.4 氧化還原相關酶及炎性因子的測定

按照脾組織質量(g)∶勻漿介質(mL) =1∶9的質量體積比加入適量預冷的0.9%的生理鹽水，冰浴研磨制成10%脾組織勻漿，轉速2 500 r·min-1離心10 min，取上清，嚴格按試劑盒說明書要求檢測SOD、MDA、GSH-Px、GSH、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、BCA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.5 Western Blot檢測脾組織NF-κB、IκB、p-IκB蛋白表達水平

每組隨機選取6只大鼠脾組織，稱取約90 mg，按組織質量(mg)∶RIPA裂解液(mL)=1∶10的質量體積比加入RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液，再按照PMSF(mL)∶RIPA(mL)=1∶100的體積比加入相應體積的PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)，冰浴研磨，直至組織充分裂解。裂解后的樣品4 ℃、12 000 r·min-1，離心15 min，取上清，BCA法測定總蛋白，并按照比例加入RIPA稀釋液和5 ×SDS(sodium dodecyl sulfate)上樣緩沖液，沸水浴變性5 min，制得蛋白樣品。每條泳道加入60 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，根據彩虹marker標識的目標蛋白位置將目標條帶轉移至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST(Tris-buffered saline containing 0.1% Tween)室溫封閉1～2 h，放入GAPDH(1:5 000)、NF-κB (1:1 000)、IκB(1:1 000)、p-IκB(1:1 000)特異性抗體中4 ℃水平搖床過夜，TBST漂洗后室溫二抗(1:2 000)孵育2 h。加適量發光液后凝膠成像儀曝光，保存蛋白條帶，采用Image J圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達量 =目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.6 Real Time PCR反應檢測脾組織mRNA表達水平

每組隨機選取4只大鼠脾組織，取100 mg左右進行Trizol一步法提取組織總RNA，反轉錄后得cDNA，以cDNA為模板，采用RT-PCR反應檢測大鼠脾組織(β-actin、NF-κB、IκB)mRNA相對表達水平。采用25 μL擴增反應體系，進行三步法PCR擴增反應，其中，第一步：預變性，95 ℃、30 s，1個循環；第二步：共50個循環，95 ℃、5 s(變性)，55 ℃、30 s(退火)，72 ℃、30 s(延伸)；第三步：熔解反應，60 ℃、15 s，71個循環。引物設計表見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 統計分析

2 結果(Results)

2.1 大鼠脾濕重及臟器系數變化

單因素方差分析結果顯示，與對照組比較，ACN低、中劑量組大鼠脾濕重明顯降低(P<0.05)；ACN中劑量組大鼠脾臟器系數降低(P<0.05)。與高劑量組比較，NAC組大鼠脾濕重、臟器系數增加，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 大鼠脾組織脂質過氧化指標變化

與對照組相比，ACN中、高劑量組大鼠脾組織MDA含量增加(P<0.05)；高劑量組大鼠SOD、GSH-Px活力顯著增加(P<0.05)；低劑量組大鼠CAT活力顯著降低，高劑量組大鼠CAT活力顯著增加(P<0.05)；低劑量組大鼠GSH含量、T-AOC活力顯著降低(P<0.05)。與高劑量組比較，NAC組大鼠MDA含量、SOD活性、CAT活性、GSH含量、GSH-Px活性、T-AOC含量顯著降低(P<0.05)。

2.3 脾組織炎性因子水平變化

與對照組比較，ACN中、高劑量組大鼠脾組織內IL-1β含量降低(P<0.05)，ACN各劑量組大鼠脾組織內TNF-α含量增加(P<0.05)。與高劑量組比較，NAC組大鼠脾TNF-α含量降低(P<0.05)。

2.4 ACN染毒后大鼠脾組織NF-κB(p65)相關蛋白表達變化

Western Blot結果示，ACN中、高劑量組大鼠脾NF-κB、IκB、p-IκB蛋白表達水平與對照組比較均升高(P<0.05)。NAC組大鼠脾IκB、p-IκB蛋白表達水平與ACN高劑量組比較降低(P<0.05)。

表2 大鼠脾濕重及臟器系數變化Table 2 Changes of the rats spleen wet weight and organ coefficient

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。臟器系數(%)=臟器濕重(g)/體重(g)×100。ACN表示丙烯腈，NAC表示N-乙酰半胱氨酸。

Note: compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6. organ coefficient (%)=wet weight of organ (g)/weight (g). ACN stands for acrylonitrile; NAC stands for N-acetylcysteine.

表3 大鼠脾組織脂質過氧化指標變化Table 3 Changes of lipid peroxidation index in rat spleen

注：MDA、SOD、CAT、GSH、GSH-Px、T-AOC表示丙二醛、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化能力。與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。

Note: MDA, SOD, CAT, GSH, GSH-Px, T-AOC stand for malondialdehyde, superoxide dismutase, catalase, glutathione, glutathione peroxidase and total antioxidant capacity. Compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6.

圖1 ACN染毒后NF-κB激活的免疫印跡分析注：A，Western Blot NF-κB、IκB、p-IκB蛋白條帶。B～D，Western Blot NF-κB、IκB、p-IκB蛋白條帶半定量分析。與對照組比較，* P<0.05；與高劑量組比較，# P<0.05；n=6。Fig. 1 Western Blot analysis on activation of NF-κB induced by ACNNote: A, Western Blot bands of NF-κB, IκB and p-IκB proteins; B～D, semi-quantitative analysis on Western Blot of NF-κB, IκB and p-IκB. Compared with control, * P<0.05; compared with high dose group, # P<0.05; n=6.

表4 脾組織炎性因子水平變化Table 4 Changes in the level of inflammatory factors in spleen tissue of rats

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。

Note: Compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6.

表5 ACN染毒后大鼠脾組織NF-κB(p65)相關蛋白表達變化Table 5 Changes of NF-κB (p65) related protein expression in rat spleen after ACN exposure

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。

Note: Compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6.

2.5 ACN染毒后大鼠脾NF-κB相關基因表達變化

RT-PCR結果顯示，ACN各劑量染毒組大鼠脾NF-κBmRNA表達水平均高于對照組(P<0.05)；ACN中、高劑量組大鼠脾IκBmRNA表達水平與對照組比較均升高(P<0.05)。NAC組大鼠脾NF-κBmRNA表達水平低于ACN高劑量組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

臟器系數能敏感地反映臟器受到毒物的毒性反應，其數值大小的改變與臟器的損傷程度有明顯的相關關系[10]。正常狀態下，動物各臟器的臟器系數比較固定，免疫器官的臟器指數是衡量機體免疫功能的初步觀察指標。本研究結果發現ACN染毒后脾臟器系數減小，提示該組織可能出現了萎縮、退行性變化。

氧化應激是由于機體內自由基過量產生導致機體氧化-抗氧化作用失衡的一種病理應激狀態。GSH是非酶自由基清除劑，其含量常作為機體抗氧化能力大小的指標之一[11]。本研究發現低劑量染毒組大鼠脾GSH含量顯著降低，可能是因為ACN及其代謝產物2-氰環氧乙烷(CEO)與體內GSH結合，使機體內GSH含量下降。GSH-Px是一種含有巰基的重要的抗氧化酶，本研究發現，高劑量組大鼠脾組織GSH-Px活性顯著增加，可能是因為ACN染毒后在其代謝過程中產生了過多的自由基，機體為了維持其本身的氧化-抗氧化之間的平衡狀態，代償性增高抗氧化酶GSH-Px。MDA含量多少與體內細胞被破壞程度存在明顯的相關關系，本研究發現中、高劑量染毒組大鼠脾MDA含量顯著升高，與黨瑜慧等[12]結論相似，提示ACN能夠引起脾脂質過氧化損傷。SOD是生物體內清除大量自由基的關鍵物質，一旦SOD活性降低，積累過氧化氫，刺激脂質過氧化反應和氧化反應來破壞細胞[13]，本研究結果顯示，高劑量組大鼠脾SOD活力升高，可能原因是ACN在體內代謝過程中產生大量·O2-，機體內SOD升高清除·O2-來維持氧化-抗氧化平衡[14]。CAT是過氧化物酶體的標志酶，可減少體內H2O2的積累，一旦CAT受到外源化學物的刺激，其反應性會增加。本研究發現，低劑量組CAT活性顯著低于對照組，高劑量組CAT活性顯著高于對照組，提示低劑量染毒可使大鼠脾臟組織CAT活力降低，減弱了機體的抗氧化能力。T-AOC是機體防御體系之一，此種機能的降低常常導致各種疾病發生。本研究發現，低劑量組大鼠脾組織T-AOC水平顯著降低(P<0.05)。此外，本研究中，與高劑量組相比，NAC組大鼠脾臟MDA、SOD、CAT、GSH、GSH-Px、T-AOC水平顯著降低，可能與NAC可以和活性氧直接發生作用，還可能與NAC能抑制ACN向其活性代謝產物CN-轉化及抑制ACN持續消耗ATP有關[15]。

IL-6是重要的促炎細胞因子，在炎性刺激下由單核細胞、淋巴細胞等炎癥免疫細胞分泌，其分泌水平可反映炎癥激烈程度。正常生理狀態下IL-6一般不表達，但在炎癥、病毒等刺激下分泌水平升高，呈高表達狀態。本研究中，與對照組比較，低、中、高劑量組大鼠脾組織內IL-6含量增加，但差異無統計學意義。IL-6有協調IL-1，誘導肝細胞合成急性期反應蛋白，可催化、放大炎性反應及毒性作用，也可與TNF-α產生協同作用，作用于血管內皮細胞，造成微循環障礙[16-17]。本研究發現，中、高劑量組IL-1β分泌水平顯著降低。此外，低、中、高劑量組TNF-α分泌水平顯著增加，表明ACN引起促炎因子TNF-α異常釋放。NAC干預后，大鼠脾TNF-α分泌水平顯著降低，說明NAC可使脾組織TNF-α表達降低，從而起到免疫調節作用。

表6 ACN染毒后大鼠脾NF-κB相關基因表達變化Table 6 Changes of NF-κB related gene expression in rat spleen after ACN exposure

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。

Note: Compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6.

NF-κB信號通路可以調節基因表達，并控制細胞凋亡、病毒復制、腫瘤發生、炎癥以及各種自身免疫性疾病[18]。同時，NF-κB信號通路在免疫、炎癥和腫瘤形成過程中還能協調、驅動細胞活化和增殖[19]。NF-κB通常與其抑制因子IκB結合，以非活性形式存在于細胞質中，當細胞受到上游刺激因子，如ROS、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、細菌脂多糖(LPS)等的作用時而激活[20-22]。NF-κB還可反饋調節，通過迅速合成IκB終止轉錄，維持細胞自身的穩定性[23]。Dang等[24]研究發現，ACN染毒后大鼠睪丸NF-κB蛋白相對表達量升高，經NAC預處理后，NF-κB的活化受到抑制。本研究結果顯示，中、高劑量染毒組大鼠脾NF-κB、IκB、p-IκB蛋白表達水平與對照組比較升高(P<0.05)。RT-PCR結果顯示，低、中、高ACN染毒組大鼠脾NF-κBmRNA表達水平與對照組比較均升高(P<0.05)；中、高ACN染毒組大鼠脾IκBmRNA表達水平與對照組比較均升高(P<0.05)?？赡苁且驗镹F-κB被活化后上調了IκB的表達，而IκB同時又被磷酸化。NAC組大鼠脾IκB、p-IκB蛋白表達水平與高ACN組比較降低(P<0.05)，NF-κBmRNA表達水平與高劑量組比較降低(P<0.05)，NF-κB的激活顯著受到抑制，這是因為NAC作為一種有效的抗氧化劑，可以通過抑制氧化應激，拮抗NF-κB的活化和其在核內的表達[8]。提示ACN染毒后大鼠脾NF-κB信號通路的激活是由氧化應激引起。

綜上所述，ACN亞急性染毒可對大鼠脾產生氧化損傷和免疫系統響應，NAC可通過拮抗作用減輕大鼠脾損傷程度。