大氣細顆粒物對小鼠T淋巴細胞亞群的影響

侯天芳，王廣發(fā)，陳乾華,*

1. 航空總醫(yī)院呼吸科，北京 100012 2. 北京大學第一醫(yī)院呼吸和危重癥科，北京 100034

流行病學研究顯示PM2.5與慢性炎癥性疾病的發(fā)病和死亡率增加密切相關[1-2]，但其致病機制目前尚不清楚。因此了解PM2.5危害人類健康的機制，對闡明大氣污染引發(fā)健康損害、死亡及醫(yī)療費用增加具有非常重要的意義。目前已知Th1/Th2的平衡對機體免疫及健康具有非常重要的意義，其參與許多氣道慢性炎癥性疾病的病理生理過程，也已成為部分疾病例如哮喘等疾病治療的新的靶位[3]，大氣顆粒物對肺部免疫系統(tǒng)有潛在的毒性作用，既往研究表明炎癥及免疫失衡可能是其重要機制[4-5]。由于流式細胞術快速靈活定量的特點，特別是和單克隆抗體結合應用后，在免疫細胞分型、分選及特性研究方面有著非常重要的作用，本文采用流式細胞術檢測大氣細顆粒物氣管滴注后小鼠肺臟淋巴細胞亞群Th1/Th2比例，以期為大氣顆粒物誘發(fā)免疫毒理失衡方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 主要實驗設備及試劑

所用流式細胞儀為BD influx，Anti-CD3抗體(Abcam)、Anti-CD4抗體(Abcam)、cell activation cocktail (without Brefeldin A) (Biolegend)、PE-anti-mouse CD4 (Biolegend)、APC-anti-mouse、IL-4 (Biolegend)、PE/Cy7-anti-mouse INF-γ (Biolegend)、固定破膜劑(Biolegend)。

1.1.2 PM2.5顆粒的采集、提取和懸液制備

顆粒物采集：采樣點為北京大學第一醫(yī)院內科樓樓頂，應用Staplex PM2.5大流量采樣器，流量為1.13 m3·min-1，流量精度3%，玻璃纖維濾膜(20.3 cm×25.4 cm)收集顆粒物，于2016年1月連續(xù)采樣96 h。

顆粒物提取及PM2.5顆粒物懸液的制備參考既往文獻[6]。于動物實驗前一天用生理鹽水配制不同濃度的細顆粒物混懸液，超聲振蕩混勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们霸俅纬曊袷幓靹颉?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及處理

實驗動物為北京維通利華實驗動物技術有限公司(生產許可證編號 SCXK(京)2012-0001)提供的28只SPF級8周齡雄性BALB/c小鼠，體重為(25±2) g，在北京大學第一醫(yī)院動物實驗中心(SYXK(京)2014-0010)飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境中。小鼠自由進食飼料及飲水。室溫23～25 ℃，12 h光/12 h黑暗(8:00—20:00開燈；20:00—8:00熄燈)，濕度25%～30%。小鼠適應性飼養(yǎng)一周后開始實驗。通過了實驗動物福利倫理審查(動物倫理編號：J201609)，根據(jù)PM2.5暴露的劑量不同隨機分為4組：生理鹽水對照組(NS control group)、PM2.5低劑量暴露組(2.5 mg·kg-1)、PM2.5中劑量暴露組(10 mg·kg-1)及PM2.5高劑量暴露組(20 mg·kg-1)，對照組給予等體積的無菌生理鹽水溶液。建模方法采用氣管滴注，氣管滴注量為50 μL·只-1·次-1，用5%水合氯醛麻醉處理，一周滴注2次，氣管滴注14 d后麻醉處死取材。

1.2.2 肺組織病理學觀察

氣道滴注末次暴露結束后24 h內過量麻醉處死小鼠。采用氣管灌注10%福爾馬林溶液固定法固定小鼠整個左肺后，左肺重新投入10%福爾馬林固定液再固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，后續(xù)進行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學Envision染色，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.3 肺臟淋巴細胞的獲取

全程無菌條件下進行操作，用剪刀剪碎肺臟，用10 mL玻璃注射器針芯輕輕捻磨肺臟，加入I型膠原酶加DNase酶消化肺組織細胞，置于37 ℃恒溫孵育箱消化1 h后，用70 μm無菌細胞篩網(wǎng)過濾一次后收集肺臟單細胞懸液至離心管中。用吸管小心吸取肺臟組織單細胞懸液加于分離液液面上，400～500 g，離心20～30 min，離心后，用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一離心管中，向離心管中加入5～10 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)液，反復洗滌2遍，計數(shù)肺臟淋巴細胞。

1.2.4 流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群比例

獲取的淋巴細胞混勻后置于6孔培養(yǎng)皿內，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育刺激阻斷6 h。刺激后的細胞收集，PBS洗2遍，測定細胞密度1×107mL-1，按照細胞表面熒光染色方案，進行CD4+T淋巴細胞表面染色后，固定破膜進行胞內抗體染色，嚴格按照試劑說明書操作程序進行染色。

1.3 統(tǒng)計學分析

圖1 大氣細顆粒物滴注后肺組織病理學變化注：(A)對照組肺終末細支氣管和肺泡上皮細胞結構；(B)低劑量暴露組肺組織顯示支氣管炎癥、肺間隔增寬和脫落的上皮細胞(黑色箭頭)；(C和D)高劑量暴露組可見鏡下肺泡巨噬細胞吞噬顆粒物(黑色短箭頭)和肺泡內炎性細胞浸潤(黑色長箭頭)；bar=200 μm。Fig. 1 Histopathological changes in lung after an intratracheal instillation of PM2.5Note: (A) A Control lung showing terminal bronchiole and alveolar epithelia; (B) Mice lung instilled with 5 mg·kg-1 PM2.5 showing bronchiole with inflammation, lung widened interval partly and falling off of epithelial cells (black arrow); (C and D ) Mice lung instilled with 20 mg·kg-1 PM2.5 showing alveolar macrophages with engulfed particles (black short arrows) and inflammatory infiltration in bronchiole and alveolar (black long arrow); bar=200 μm.

圖2 大氣細顆粒物暴露后小鼠肺組織免疫組化結果Fig. 2 Immunohistochemical results of lung tissue in mice after exposure to fine particulate matter

2 結果(Results)

2.1 大氣細顆粒物氣管滴注小鼠后肺組織HE染色病理變化

圖1A可見生理鹽水對照組小鼠細小支氣管和肺泡結構正常，支氣管粘膜上皮完整，支氣管腔和肺泡腔內未見炎性滲出，支氣管腔和肺泡腔內未見吞噬顆粒物質的巨噬細胞和明顯的炎細胞浸潤，無平滑肌的增生和基底膜的增厚。PM2.5暴露小鼠可見彌漫性細小支氣管和血管周圍炎性細胞的浸潤，包括中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，有淋巴濾泡的形成，未見明顯嗜酸粒細胞增多。氣道上皮有不同程度的脫落，上述改變在中高劑量組小鼠的肺組織較為明顯。高劑量暴露組細小支氣管粘膜上皮增生明顯，圖1C可見大量吞噬顆粒物質的肺泡巨噬細胞(塵細胞)，有的塵細胞已經浸潤到肺泡腔中，圖1D可見淋巴細胞浸潤。

2.2 大氣細顆粒物氣管滴注小鼠肺組織免疫組化染色結果

HE病理結果顯示在中高劑量暴露組中，鏡下可見大量的淋巴細胞浸潤，因此我們選取了中高劑量暴露組進行免疫組化染色，如圖2所示，小鼠經PM2.5高劑量暴露后肺組織光鏡下可見免疫炎性細胞明顯浸潤，染色結果提示圖2A深棕色著色區(qū)(陽性表達)為CD3+T細胞，圖2B棕色著色區(qū)(陽性表達)為CD4+T細胞，bar=100 μm。

2.3 流式細胞術檢測肺臟細胞Th1/Th2比例變化

通過流式細胞術檢測肺臟淋巴細胞Th1/Th2亞群變化，結果顯示與生理鹽水對照組相比，低中劑量時，隨著暴露劑量的增加，Th1亞群有增高趨勢，但是差異無統(tǒng)計學意義；Th2亞群在不同暴露組之間差異亦有統(tǒng)計學意義；但是，隨著暴露劑量的增加，結果顯示Th1/Th2比值逐漸增高，尤其中高劑量PM2.5暴露后差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。

3 討論(Discussion)

研究發(fā)現(xiàn)北京市冬季霧霾呈現(xiàn)重污染反復出現(xiàn)的特點[7]，這與國內外其他城市的大氣污染特征有所不同[8]。形成霧霾的主要成分是高濃度的大氣細顆粒物，其危害也最為嚴重。研究表明PM2.5是北京地區(qū)的主要污染物之一[9]，污染水平有明顯的季節(jié)變化規(guī)律，且冬季和春季的污染水平較高[10]。PM2.5是一類大小形態(tài)不同、表面成分復雜的懸浮顆粒。PM2.5表面附著有大量的有毒物質，如金屬元素、過渡金屬元素、非金屬元素、有機生物元素和碳元素等多種復雜成分[11]，其中金屬元素和過渡金屬元素作為北京市PM2.5的主要成分[12-13]，對人體健康造成的危害最為突出[14]。毒理學研究證實多種過渡金屬(包括Fe、Ni、Cu和Zn)能夠促發(fā)氧化應激和炎癥反應，從而誘導生物學危害[15-16]。本研究中所使用的PM2.5收集于北京中心城區(qū)近主干道區(qū)域，具有監(jiān)測代表性，本研究課題所檢測的重金屬和過渡金屬均為大氣細顆粒物的主要有毒成分[17-20]。由于PM2.5化學特性極為復雜，其成分以及含量不同引起的生物毒理特性也不同[21-22]。值得注意的是，近年來發(fā)現(xiàn)過渡金屬元素可以誘發(fā)機體免疫炎性損傷[23-24]。

本研究采用HE染色、免疫組化及流式細胞學等方法，探究PM2.5暴露誘發(fā)肺部淋巴細胞的失衡。首先，小鼠肺組織HE病理研究發(fā)現(xiàn)小鼠經PM2.5暴露后，隨著暴露劑量的增大及暴露次數(shù)的增多，支氣管黏膜上皮出現(xiàn)不同程度的增生，氣道上皮不同程度的脫落，肺泡間隔增寬，以及不同程度的淋巴細胞聚集及吞噬顆粒的巨噬細胞浸潤。此外，肺組織免疫組化染色結果發(fā)現(xiàn)各中高劑量組CD3+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞大量聚集，提示淋巴細胞參與炎癥反應過程。研究發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細胞平衡在調控機體免疫功能方面起到關健作用，其在免疫相關的肺損傷疾病中是一對重要的調節(jié)細胞[25-27]。

本研究通過流式細胞術對PM2.5暴露后的小鼠肺臟T淋巴細胞亞群進行檢測，結果顯示中高劑量PM2.5暴露后小鼠肺臟細胞中Th1/Th2比值增大，因此提示這種暴露模式有助于Th1占優(yōu)勢的免疫應答。近年來相關研究亦發(fā)現(xiàn)PM2.5誘發(fā)的肺部損傷中存在免疫失衡狀態(tài)[28]。這為今后大氣細顆粒物暴露誘發(fā)的肺部疾病提供理論指導，研究發(fā)現(xiàn)Th細胞的分化受多種因素的影響[29]，如抗原的種類和濃度、抗原提呈細胞的類型和局部微環(huán)境的作用等。盡管大氣顆粒物的暴露劑量、顆粒大小和組成有所不同，PM2.5暴露仍在不同程度上誘發(fā)淋巴細胞亞群比例失衡[30]。另有研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露刺激人類肺泡巨噬細胞后致使Th1相關細胞因子表達增高，而Th2相關細胞因子表達水平下降[31]，亦有研究發(fā)現(xiàn)動物暴露于大氣顆粒物后支氣管肺泡灌洗液中Th2相關細胞因子反而增高[32]，這種T淋巴失衡方向的不完全統(tǒng)一，考慮與研究設計、PM2.5表面復雜的成分及暴露后時相不同等有關。

表1 流式細胞術檢測肺臟細胞Th1/Th2比例結果Table 1 The result of Th1/Th2 in mice lung detected by flow cytometry n=7)

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note: *P<0.05, compared with the control group.

本文通過流式細胞術檢測大氣細顆粒物氣管滴注后小鼠肺細胞中Th1/Th2比例，高劑量暴露后小鼠肺臟淋巴細胞亞群向Th1偏移，為進一步了解大氣顆粒物誘發(fā)免疫毒理失衡方面奠定科學基礎。