4-壬基酚對擬柱胞藻生長、抗氧化酶和光合作用的影響及機理

喻燚，李巧玉，董聰聰，張紅波，向蓉，施軍瓊，吳忠興

西南大學三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶市三峽庫區植物生態與資源重點實驗室，重慶 400715

壬基酚(nonylphenol, NP)是非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚(nonylphenol polyethoxylates, NPEOs)合成原料[1]，同時也是其降解代謝產物。壬基酚是一種環境激素類似物[2]，與1,7-β-雌二醇(雌激素的一種)具有相似的化學結構，因而具有雌激素的性質，能代替雌激素作用于雌激素的受體，從而抑制生物體內雌激素的作用，干擾生物體內正常代謝活動，因此被列入環境內分泌干擾物(EDCS)和33種優先污染物名錄中[3]。2005年美國環保局(EPA)指出壬基酚在淡水中的濃度應低于6.6 μg·L-1，海水中濃度應低于1.7 μg·L-1 [4]。然而，近些年來，在我國水體如天津河流[5]、黃河[6]、長江[7]、膠州灣水體[8]、湄洲海灣水域[9]等均發現不同濃度的壬基酚，如嘉陵江和長江自然水樣中壬基酚濃度為0.02～6.85 μg·L-1，而膠州灣附近墨水河壬基酚濃度達28.656 μg·L-1，其濃度遠遠高于EPA參考濃度。陳慰雙[10]的研究表明大遼河流域部分站位、黃河蘭州段水體部分站位、海河流域部分站位及香港米埔濕地壬基酚的污染水平已經對該地區生態系統造成威脅，并危害水生動植物的生長。因此，探討壬基酚的生態毒性和風險評估顯得尤為重要。然而，目前關于壬基酚的毒性研究主要集中在哺乳動物[11]、魚類[12-13]及其他水生動物[14]的毒理研究上。研究表明壬基酚對小鼠的中樞神經系統有一定的損傷作用[15]；對鯽(Carassiusauratus)肝細胞具有一定的毒性作用[16]；還能引起端足類河蜾蠃蜚(Corophiumacherusicum)DNA的損傷，且損傷程度呈顯著的劑量-效應關系[17]。

藻類是水生生態系統食物鏈的起點，也是最重要的初級生產者，其可將無機營養元素轉移至更高級的有機生命體，擔負著物質循環和能量流動的重要任務[18]。因此，開展壬基酚對微藻毒性效應的研究對壬基酚的生態風險評估具有重要意義。有研究表明壬基酚對三角褐指藻(Phaeodactylumtriconutum)的生長具有明顯的毒性效應，并可以造成抗氧化酶系統和光合系統的損傷[19]；壬基酚能使微小小環藻(Cyclotellacaspia)細胞生長速率減慢，葉綠素a含量下降，細胞畸形率增大[20]。雖有不少壬基酚對藻類的毒理學研究，但主要集中在硅藻和綠藻等真核藻類方面，而對水體浮游植物另一重要組成原核藻類—藍藻的方面，特別是光合生理方面的研究相對較少。因此，為了探討壬基酚對藍藻的影響，本文以擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii)為研究對象，本實驗通過測定不同濃度下壬基酚對擬柱胞藻生長、光合系統Ⅱ相關參數及抗氧化酶的影響，旨在探究壬基酚對擬柱胞藻毒性效應，為揭示壬基酚對浮游植物的致毒方式和機理以及生態風險評價提供一定的理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

擬柱胞藻(C.raciborskiiFACHB-1096)由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。將藻擴大培養至指數生長期，離心去上清后轉接到250 mL錐形瓶150 mL MA培養基中，接種OD為0.15。實驗采用丙酮(化學純，中國國藥有限公司)作為助溶劑，配制丙酮的6個體積濃度系列：0、1‰、3‰、5‰、7‰和10‰，48 h培養后用浮游植物計數框顯微計數，測定藻細胞的密度，計算得到丙酮對擬柱胞藻的不可見效應劑量(no observed effect level, NOEL)為5‰。參考野外水體濃度和相關文獻，并結合預實驗結果，設定4-壬基酚(優級純，中國國藥有限公司)終濃度為0.00、0.05、0.10、0.50、1.00和2.00 mg·L-1。培養條件為光照強度30μE·(m2·S)-1，溫度25 ℃，光暗比12 h:12 h。每個濃度設置3個重復，以不添加4-壬基酚(0.00 mg·L-1)為對照組。每天定時搖動3次，使藻細胞充分與培養液接觸。取樣測量0 h、24 h、48 h、72 h、96 h的藻液OD值，并測量暴露96 h后藻細胞的葉綠素a含量。根據實驗數據，通過線性回歸分析計算NP對擬柱胞藻的96 h-EC50。

1.2 葉綠素a的測定

取不同濃度處理96 h的藻液各5 mL，離心后去上清，加入90%的丙酮進行提取，測定663 nm、645 nm下的OD值，用公式Chl a (mg·L-1)=(12.72×OD663-2.7×OD645)×Vt/V計算葉綠素的濃度，其中Vt為提取后定容的體積，V為提取所用的藻液體積[21]。

1.3 快速光曲線(RLCs)和最大光化學效率

用浮游植物熒光分析儀(PHYTO-PAM, Waltz公司，德國)測定藻細胞的最大光化學效率及電子傳遞速率，測定方法參見Maxwell等[22]的方法。快速光曲線數據采用以下等式的非線性曲線擬合過程擬合[23]：

rETR=rETRmax[1-e-(α·PAR/rETRmax)]e-(β·PAR/rETRmax)

rETRmax是最大相對潛在電子傳遞速率，α是RLC的初始斜率，PAR是光照度，β是在PSII下降的點上RLC的斜率，半飽和光強IK=rETRmax/α[24]。

1.4 PSⅡ快速葉綠素熒光動力學曲線(OJIP)的測定

藻體脅迫培養96 h后，每個處理各取2 mL藻液置黑暗中暗適應20 min后，測定快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP)。快速葉綠素熒光誘導動力學曲線采用植物效率分析儀(PEA, 英國漢莎科技有限公司，英國)測定，測定光強為3 000μmol·m-2·s-1，最大激發波長650 nm，記錄了從10μs到2 s葉綠素熒光的變化過程，從而準確記錄O-J-I-P等相。快速葉綠素熒光動力學曲線由O點到P點的所有熒光需進行標準化，以對數形式進行表示。通過OJIP曲線的變化，獲得了以下參數：單位受光面積有活性反應中心的數量(RC/CS0)，t=0時最大光化學效率(ΦP0)，t=0時捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過醌分子(QA)的其他電子受體的概率(ψ0)，t=0時用于電子傳遞的量子產額(ΦE0)，單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)，t=0時單位反應中心耗散掉的能量(DI0/RC)，t=0時單位反應中心捕獲的用于還原QA的能量(TR0/RC)，t=0時單位反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ET0/RC)，從0到tFmax時間段QA-/QA的平均氧化還原態(Sm/t(Fm))[25]。

1.5 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的測定

酶液提取采用細胞凍融法，分別吸取不同濃度處理96 h的藻液各50 mL，離心去除上清液，加入定量磷酸鹽緩沖液(PBS) pH=7.5，置于-80 ℃冷凍，經反復凍融后，離心提取酶液。蛋白質的測定參照考馬斯亮藍法[26]、SOD和CAT活性的測定分別參照Wu等[27]和Choo等[28]的方法。

1.6 數據分析

實驗數據處理使用SPSS 16.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)及LSD法(P<0.05)檢驗處理組與對照組之間的差異，“*”、“**”、“***”表示P<0.05、P<0.01、P<0.001，差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 不同濃度4-壬基酚處理下擬柱胞藻葉綠素a含量的變化

不同濃度壬基酚處理96 h后，結果(圖1)顯示，與對照組葉綠素含量相比，0.05、0.10 mg·L-1處理組葉綠素a含量顯著增加(P<0.001)，分別增加了21.32%、27.27%。然而，在0.50、1.00、2.00 mg·L-1壬基酚中培養96 h后，各處理的葉綠素a顯著低于對照組(P<0.001)，分別減少了77.96%、88.77%、94.18%。當濃度>1 mg·L-1時培養瓶底部出現大量無色或白色的藻細胞沉淀物。根據回歸曲線，4-壬基酚對擬柱胞藻的96 h半數效應濃度(96 h-EC50)為0.457 mg·L-1。

圖1 不同濃度4-壬基酚處理后擬柱胞藻的葉綠素含量注：與對照組比較，“***”表示P<0.001，差異顯著，下同。Fig. 1 Effect of different concentrations of 4-nonylphenol on chlorophyll a content in C. raciborskiiNote: compared with the control,“***”represents significant difference at P<0.001. The same below.

圖2 不同濃度4-壬基酚對擬柱胞藻Fv/Fm的影響Fig. 2 The maximum photochemicial effeciency (Fv/Fm) for the responses of C. raciborskii to different concentrations of 4-nonylphenol

2.2 最大光化學效率(Fv/Fm)的變化

如圖2所示，在不同濃度4-壬基酚處理96 h后，與對照組相比，0.05 mg·L-1和0.10 mg·L-1處理組的Fv/Fm無顯著差異，而在0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1和2.00 mg·L-1處理后，Fv/Fm分別下降了50.99%、88.08%和100%，具有顯著的差異(P<0.001)。

2.3 快速光響應曲線(RLC)

4-壬基酚處理96 h后，當壬基酚濃度大于0.50 mg·L-1時，與對照組相比，RLC發生顯著降低；當4-壬基酚濃度為2 mg·L-1時，檢測不出熒光值(圖3)。與對照組相比，0.05 mg·L-1處理組α值無明顯變化，當濃度大于0.10 mg·L-1時，隨著濃度增加，α明顯下降(P<0.01)，0.50、1.00、2.00 mg·L-1處理組α值分別減少了46.58%、77.17%和100%；當濃度大于0.1 mg·L-1時，處理組的rETRmax發生了明顯變化(P<0.01)，其中0.1 mg·L-1處理組的rETRmax增加了5.36%，0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1處理組rETRmax分別減少了78.43%、94.31%、100%；所有處理組的IK值均發生了明顯變化(P<0.01)，其中0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1處理組的IK值分別增加了11.8%、17.19%，0.50、1.00、2.00 mg·L-1處理組IK值分別減少了61.16%、76.23%、100% (表1)。

圖3 不同濃度4-壬基酚對擬柱胞藻快速光曲線的影響Fig. 3 Rapid light curves of C. raciborskii under the influence of different concentrations of 4-nonylphenol following 48-h treatmentNote: rETR stands for electron transport rates; PAR stands for photosynthetic active radiation.

表1 擬柱胞藻經4-壬基酚處理后的光合參數變化Table 1 Changes in the photosynthetic parameters of C. raciborskii following treatment with 4-nonylphenol

注：每個值是3個重復的平均值±標準誤；**表示P<0.01，與對照組比較，下同。α表示斜率；rETRmax表示最大電子傳遞速率；IK表示飽和光強。

圖4 不同濃度4-壬基酚對擬柱胞藻葉綠素熒光參數(JIP-test)的影響注：RC/Cs0、ABS/RC、DI0/RC、TR0/RC、ET0/RC分別表示單位受光面積有活性反應中心的數量、單位反應中心吸收的光能、 單位反應中心耗散掉的能量、單位反應中心捕獲的用于還原QA的能量、單位反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量； ΦP0、ψ0、ΦE0、Sm/t(Fm)分別表示最大光化學效率、捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的概率、用于電子傳遞 的量子產額、從0到tFmax時間間隔QA-/QA平均氧化還原狀態。*、**表示P<0.05、P<0.01，與對照組比較，下同。Fig. 4 Changes in the JIP test parameters and expressed as a percentage of the control when C. raciborskii were exposed for 96 h to various concentrations of 4-nonylphenolNote: RC/Cs0, ABS/RC, DI0/RC, TR0/RC, ET0/RC stand for density of reaction centers (RC), absorption flux per RC, dissipated energy flux per RC, trapped energy flux per RC, electron transport flux per RC, respectively; ΦP0, ψ0, ΦE0, Sm/t(Fm) stand for maximum quantum yield of primary photochemistry, probability that a trapped exciton moves an electron into the electron transport chain beyond QA-, quantum yield of electron transport, the average redox state of QA-/QA in the time span from 0 to tFmax, respectively. *, ** indicate P<0.05, P<0.01, compared with the control; the same below.

2.4 PSII葉綠素熒光參數的變化

不同濃度4-壬基酚處理后，擬柱胞藻葉綠素熒光參數反應活性中心所捕獲的光能(ABS/RC)、反應活性中心耗散掉的能量(DI0/RC)、反應活性中心(RC)所捕獲的激發能用于還原QA的能量(使QA減少從而還原成QA-，TR0/RC)、反應活性中心的捕獲的光能用于電子傳遞的能量(QA--QB--PQ，ET0/RC)、熒光參數單位受光面積的反應活性中心數量(RC/Cs0)、最大光化學效率(ΦP0)、光照2 ms時有活性的反應中心開放程度(ψ0)、反應中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產額(ΦE0)及從0到tFmax時間段QA-/QA的平均氧化還原態Sm/t(Fm)的變化情況如圖4所示。與對照相比，當4-壬基酚濃度小于0.10 mg·L-1，擬柱胞藻各參數未表現出明顯的差異(P>0.05)。當濃度高于0.50 mg·L-1，擬柱胞藻ABS/RC、DI0/RC和TR0/RC均顯著增加(P<0.05)，而RC/Cs0、ET0/RC、ΦP0、ΦE0、ψ0和Sm/t(Fm)均顯著下降(P<0.05)。當4-壬基酚濃度為1.0 mg·L-1時，ABS/RC、DI0/RC和TR0/RC分別增加到對照組的235.23%、321.05%和118.10%，而RC/Cs0、ET0/RC、ΦP0、ΦE0、ψ0和Sm/t(Fm)則分別比對照下降了96.19%、83.72%、93.02%、86.04%、48.95%和63.30%。

2.5 抗氧化酶活性的變化

在不同濃度4-壬基酚處理96 h后，與對照組相比，0.05和0.10 mg·L-1處理組SOD和CAT活性無明顯變化。然而，當濃度大于0.50 mg·L-1時，隨著濃度增加，SOD、CAT的活性明顯增加(P<0.01)，0.50、1.00和2.00 mg·L-1組SOD的活性分別是對照組的3.65、13.78和15.65倍，CAT的活性分別是對照組的2.02、3.14和3.49倍。

3 討論(Discussions)

葉綠素是光合作用的重要組成部分，葉綠素含量與光合速率、營養狀況等密切相關，測定葉綠素的含量是表征植物生長與光合作用狀況重要標志[29]。本次研究得到，低濃度4-壬基酚處理下(<0.1 mg·L-1)，在高濃度(>0.5 mg·L-1)處理下，葉綠素的合成受到明顯抑制(圖1)。這與Liu等[30]對Cyclotellacaspia和Gao等[31]對Chlorellavulgaris和Selenastrumcapricornutum的結果相似。當濃度>1 mg·L-1時培養瓶底部出現大量無色或白色的藻細胞沉淀物，表明藻細胞葉綠素產生脫鎂的效應，導致細胞中葉綠素失活，其大量產生說明藻類全部死亡。這表明與真核藻類相似，高濃度處理會使得擬柱胞藻藻細胞的葉綠體結構受到破壞，葉綠素的合成受阻，從而導致葉綠素含量降低，生長受抑制。4-壬基酚處理96 h，擬柱胞藻的半致死濃度(EC50)為0.457 mg·L-1，與球形棕囊藻96 h-EC50相似(0.42 mg·L-1)[32]。然而，低于三角褐指藻、蛋白核小球藻的96 h-EC50，分別為0.84 mg·L-1 [19]和3.13 mg·L-1[31]。然而，低濃度處理96 h后，擬柱胞藻的葉綠素含量增加(圖1)，表明低濃度的壬基酚促進擬柱胞藻的葉綠素的合成，這與Liu等[30]、Gao等[31]和管超等[32]對真核藻類的研究結果不同，表明在低濃度壬基酚暴露下，擬柱胞藻可能產生了毒物興奮效應。目前，已報到水體中的壬基酚檢測濃度均為低劑量[6-9]，藍藻的4-壬基酚毒物興奮效應可能導致水體藍藻的競爭優勢。

光合作用為植物提供物質與能量，是植物生長發育的重要保障[33-34]。當植物體遭受一定條件的脅迫，其葉綠體的膜結構遭到破壞，葉綠素含量將隨葉綠體膜結構的解體而降低，進而降低植物的光合能力[35]。Fv/Fm表示PSII最大光量子產量，當遭受外界脅迫時，該參數明顯下降[36]。Gao等[31]對C.vulgaris和S.capricornutum、Zhou等[37]對Scenedesmusobliquus研究也得到了高濃度處理下Fv/Fm受到明顯抑制。本研究發現當濃度高于0.5 mg·L-1，擬柱胞藻的Fv/Fm隨濃度增加而減少(圖2)，表明擬柱胞藻的光合作用受到抑制作用，其原因可能是葉綠素的合成受阻，導致了光量子的產量受到抑制。rETRmax表示光合效率的大小，被用來描述PSII的最大光化學效率和開放氧化反應中心的比例[38]。本次研究得到，在壬基酚濃度>0.5 mg·L-1時，擬柱胞藻的rETRmax隨濃度增加而減小(表1)，這和Fv/Fm的結果一致，表明擬柱胞藻的光合作用受到了抑制。α是快速光曲線的初始斜率，表示藻的捕光能力[39]，本研究發現當濃度高于0.5 mg·L-1，擬柱胞藻的α隨濃度增加而減少(表1)，表明擬柱胞藻在高濃度壬基酚的脅迫下捕光能力減弱。IK的大小表示植物耐受強光的能力[39]，本研究發現當濃度高于0.5 mg·L-1，擬柱胞藻的IK隨濃度增加而減少(表2)，表明在高濃度壬基酚的脅迫下，擬柱胞藻耐受強光的能力減弱。當壬基酚濃度高于2 mg·L-1時，擬柱胞藻葉綠素熒光不能檢測，也支持了管超等[32]對棕囊藻研究的結論。然而，與前人對真核藻類的研究不同，低濃度下，擬柱胞藻的rETRmax和IK增大，表明4-壬基酚對擬柱胞藻產生了毒性興奮效應，進一步支持了葉綠素的結果。

圖5 不同濃度4-壬基酚處理后擬柱胞藻抗氧化酶活性注：(a)超氧化物酶(SOD)，(b)過氧化氫酶(CAT)。Fig. 5 Effect of different concentrations of 4-nonylphenol on the antioxidase activity of C. raciborskiiNote: (a) superoxide dismutase (SOD); (b) catalase (CAT).

由于葉綠素熒光曲線提供了大量關于PSII反應中心原初光化學反應的信息，因此葉綠素熒光參數被認為是分析環境脅迫條件光合系統II(PSII)行為的敏感指標參數[40]。本研究發現在高濃度4-壬基酚處理下，擬柱胞藻的光合機構的比活性，即活躍的單位反應中心(RC)的各種量子效率(ABS/RC、DI0/RC、TR0/RC)均顯著增加(圖4A)，表明了高濃度4-壬基酚處理增加了擬柱胞藻反應活性中心所捕獲的光能，然而，這些捕獲的能量主要被反應活性中心耗散掉，導致了QA-的大量積累[25]。同時，高濃度4-壬基酚處理也導致了擬柱胞藻單位面積上的反應中心的數量(RC/Cs0)、反應中心的最大光化學效率(ΦP0)、反應中心用來推動電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的激子比率(ψ0)、反應中心用來推動電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的概率(ΦE0)及QA-/QA的平均氧化還原態(Sm/t(Fm))均顯著降低(圖4)，進一步表明了高濃度4-壬基酚破壞了擬柱胞藻的光合反應中心，導致了PSII供體側的電子供體和受體側電子受體受到了毒害作用，反應活性中心捕獲的能量更多地用于QA還原為QA-，減少了用于電子傳遞的能量，進而抑制了QA-到QB的電子傳遞，QA-大量積累，增加質體醌(PQ)庫的庫容量，從而抑制了光合作用[40]，該結果與擬柱胞藻的rETRmax隨濃度增加而減小的結論相一致。

植物在逆境脅迫下，會產生過量的氧自由基，抗氧化酶防御系統是植物保護自身免受氧自由基毒害的防御系統，其中SOD和CAT是2種重要的抗氧化損傷保護酶[40]，SOD將氧自由基轉變為H2O2和O2，CAT進一步將H2O2轉變為H2O和O2，植物通過這2種酶的相互協作，消除或減少氧自由基和過氧化氫的毒性[41-42]。本研究發現高濃度壬基酚處理后，擬柱胞藻的SOD和CAT活性均顯著增加，支持了Liu等[30]和Gao等[31]的研究發現，表明高濃度壬基酚刺激藻細胞體內產生的大量氧自由基，植物為了生長必須清除這些氧自由基，因而合成大量SOD和CAT，使得SOD和CAT活性增加。然而，低濃度處理組中，擬柱胞藻的SOD和CAT與對照沒有顯著性差異(圖5)，表明低濃度對擬柱胞藻未產生毒害。

綜上所述，與真核藻類一樣，高濃度4-壬基酚處理下，擬柱胞藻的葉綠素合成受阻，光合色素減少，光合反應中心結構受損，QA-大量積累，光合效率下降，抑制藻細胞的光合作用，導致了擬柱胞藻生長受到阻礙。同時，高濃度處理導致藻細胞內產生大量氧自由基，為了清除氧自由基，細胞內抗氧化酶活性急劇增加。然而，與真核藻類不同，低濃度壬基酚處理下，擬柱胞藻則可能表現出毒物興奮效應。因此，研究壬基酚對藍藻的影響不僅需注意高濃度產生的急性毒理效應，也應該關注低濃度下產生的效應問題。