氟離子慢性暴露對中國林蛙蝌蚪生長發育的毒性效應研究

李艷斌，柴麗紅,*

1. 長安大學 環境科學與工程學院，西安 710054 2. 旱區地下水文與生態效應教育部重點實驗室(長安大學)，西安 710054

氟是鹵族元素之一。由于氟的化學性質活潑，在自然界幾乎不以氟單體的形式存在，而是與其他元素結合形成無機和有機氟化物[1]。氟作為一種動物及人體發育必需的微量元素，適量氟攝取有益于齲齒預防和骨骼發育，然而過量氟攝取會對動物及人體健康造成危害[2-3]。自然界地表水中氟離子的濃度通常為“0.0～0.3 mg·L-1”[4]，然而金屬冶煉、有機肥料的加工、含氟“三廢”的排放等人類活動導致水環境中氟含量持續升高[5-8]。有關報道表明，我國部分地下水中氟離子(F-)濃度甚至高達45 mg·L-1[9]。因此，開展水域環境氟污染對水生生物潛在負效應的研究具有重要的意義。

目前，國內外學者針對水域氟污染對水生動物的毒性效應進行了大量研究。Alonso和Camargo[10]的研究表明，水生蝸牛(Potamopyrgusantipodarum)經20 mg·L-1F-暴露后，其游動速度與對照組相比顯著降低。Chen等[11]研究了F-對鯉魚(Cyprinuscarpio)的毒性效應，結果表明，高濃度的F-慢性暴露可抑制鯉魚的生長發育。此外有研究表明，F-脅迫可導致非洲爪蟾(Xenopus)胚胎發育畸形[12]，可抑制中華大蟾蜍(Bufogargarizans)蝌蚪的變態進程[13]。

兩棲動物幼體是研究污染物對水環境生物毒性影響的重要生物材料之一。兩棲動物的胚胎發育和幼體發育均在水域中進行，其幼體鰓和皮膚的滲透性強，對水域化學污染物極為敏感[14-16]。中國林蛙(Ranachensinensis)廣泛分布于我國華北、西北等地，是我國兩棲類最具代表性的物種之一[17]。依據Gosner[18]的分期標準，G1～G25為中國林蛙的胚胎發育期，G26～G46為中國林蛙的幼體發育期。已有的研究表明，其幼體對水域多種化學污染物如Pb2+、Cr6+等均比較敏感[19]。我們前期的研究表明中國林蛙胚胎階段的生長發育或幼體的生長發育、變態等均受到水體氟脅迫的影響[20]。然而，有關中國林蛙自胚胎階段起持續受到氟污染脅迫對其幼體生長發育、變態及骨骼發育的影響尚未見報道。

本研究以中國林蛙(Ranachensinensis)胚胎為試驗對象，按照《化學農藥環境安全評價試驗準則》和化學品測試方法[21-23]的要求,經不同濃度的F-水體慢性暴露，研究了F-對蝌蚪幼體全長、體長、體重、發育分期的影響以及F-對蝌蚪變態高峰期全長、體長、體重、后肢長、變態率、骨骼發育的影響,旨在為水域氟污染對兩棲動物的生態毒理效應研究提供豐富的客觀基礎資料，為水生生態系統保護和兩棲動物水質標準的制定提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

中國林蛙卵于2016年3月采自陜西省西安市秦嶺山脈大峪水庫附近無污染的小池塘，將卵帶回實驗室，依據Gosner[18]的分期標準對胚胎進行分期，選取卵黃栓期(G12期)的中國林蛙胚胎作為試驗材料。

氟化鈉(NaF)，分析純，購自Sigma-Aldrich公司。試驗前用蒸餾水配制成1 g·L-1NaF的母液，備用；試驗開始時以室溫下曝氣3 d的自來水稀釋為試驗所需質量濃度的NaF暴露溶液。

1.2 慢性毒性試驗

采用室溫下曝氣3 d的自來水作為試驗用水，水溫(20±2) ℃，pH 6.8～7.0，明暗光周期為12 h:12 h。隨機將G12的中國林蛙胚胎放入50 cm×20 cm×20 cm(長×寬×高)的玻璃缸中進行暴露處理，每缸盛試驗液4 L。依據地表水環境質量標準[24]及環境中F-的賦存濃度，NaF暴露濃度設置為0、1、10、50、100 mg·L-1，各處理組均設置4個平行缸,每缸放入50尾林蛙胚胎。胚胎期間不投食，發育至蝌蚪階段開始定時投食煮熟的菜葉和蛋黃。為了保證試驗濃度的準確性，每48小時更換全部試驗液。暴露試驗持續至任一處理組中有半數以上的蝌蚪發育至變態高峰期(G42期，前肢伸出期)時終止。

分別于暴露后25 d和40 d時，從各處理組撈取20尾蝌蚪(每缸隨機撈取5尾蝌蚪)用多聚甲醛固定，分別測量各只蝌蚪的全長(從吻端至尾端)、體長(從吻端到泄殖腔)、體重、并依據Gosner分期標準對蝌蚪進行發育分期的判斷。當蝌蚪發育至G42期時，記錄各處理組的變態進程，并對G42期蝌蚪的全長、體長、體重和后肢長進行測量。

1.3 氟離子濃度的測定

慢性暴露試驗設置的NaF濃度為0、1、10、50、100 mg·L-1，對應的F-濃度分別為0、0.45、4.52、22.62、45.24 mg·L-1。采用氟復合電極(STISE22, Ohaus Instrument Co. Ltd)測定暴露液中的實際F-的濃度[19]，測得0、1、10、50、100 mg·L-1NaF暴露液中的F-濃度分別為：0.4±0.05、0.7±0.14、4.2±0.24、19.4±1.17、42.8±1.36 mg·L-1(n=5)。

1.4 形態指標的測定

采用電子游標卡尺(桂林廣陸電子數顯游標卡尺，測量范圍150 mm,精確度0.01 mm)測定全長、體長和后肢長；用SsrtoriusBS124S型電子天平(精確度0.0001 g)測量蝌蚪體重；于Zeiss Discovery V12型體式顯微鏡下觀察蝌蚪的發育分期。

1.5 骨骼染色

取各處理組中國林蛙G42期蝌蚪各3尾進行骨骼染色。蝌蚪骨骼染色采用改良后的Taylor和Vandyke[25]的方法進行骨骼雙染色，經茜素紅(alizarin red)和阿利新蘭(alcian blue)染色后，再經甘油透明，雙染色骨骼標本硬骨呈紫紅色，軟骨呈藍色。用Zeiss Discovery V12型體式顯微鏡觀察，佳能7 D數碼相機進行圖像采集。本實驗中骨骼名稱均采用Pugener和Maglia[26]等的骨骼術語進行描述。

1.6 數據處理

實驗數據采用SPSS 22.0軟件處理。運用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各處理組蝌蚪的全長、體長、體重及后肢長的差異；通過Mann-Whitney U-test比較各處理組蝌蚪的發育分期；通過Kaplan-Meier曲線描述了各處理組蝌蚪的累積變態率。數據以平均值±標準差(X±SD)表示，P<0.05、P<0.01表示有顯著性差異。

2 結果(Results)

2.1 F-慢性暴露對中國林蛙蝌蚪生長發育的影響

中國林蛙G12期胚胎經不同濃度F-慢性暴露25 d和40 d后，各處理組蝌蚪的生長發育指標分別見圖1、圖2。慢性暴露25 d后，與對照組相比，4.2 mg·L-1F-處理組蝌蚪的全長、體長和體重均顯著增加(P<0.01)，而發育分期并未受到顯著影響(P>0.05)。然而，42.8 mg·L-1F-處理組蝌蚪的全長、體長、體重和發育分期均顯著低于對照組(P<0.01、P<0.05)(圖1)。

慢性暴露40 d后，與對照組相比，0.7 mg·L-1F-和4.2 mg·L-1F-處理組蝌蚪的全長、體長、體重和發育分期各指標均無顯著差異；而19.4 mg·L-1F-和42.8 mg·L-1F-處理組蝌蚪的全長、體長、體重和發育分期均受到顯著抑制(P<0.05、P<0.01)(圖2)。

2.2 F-慢性暴露對中國林蛙蝌蚪變態率的影響

Kaplan-Meier曲線描述了不同F-濃度處理組林蛙蝌蚪的累積變態率(圖3)。當慢性暴露試驗進行到60 d時，對照組、0.7 mg·L-1F-和4.2 mg·L-1F-處理組中開始有蝌蚪發育至G42期，而19.4 mg·L-1F-和42.8 mg·L-1F-處理組G42期蝌蚪的出現較對照組分別延遲了1 d和2 d(圖3A)。當試驗結束時(F-慢性暴露78 d)，對照組、0.7、4.2、19.4和42.8 mg·L-1F-處理組的變態率分別是43.75%、45%、50%、31.25%、18.75%(圖3B)；即與對照組相比，0.7 mg·L-1F-處理組蝌蚪的變態率未受到顯著影響(P>0.05)，4.2 mg·L-1F-處理組蝌蚪的變態率顯著升高(P<0.05)，而19.4 mg·L-1F-和42.8 mg·L-1F-慢性暴露顯著抑制了林蛙蝌蚪的變態率(P<0.05)(圖3B)。

圖1 不同濃度F-暴露25 d時對中國林蛙蝌蚪生長和發育的影響注：星號表示與對照組相比存在顯著差異(* P<0.05，** P<0.01)；數據表示X±SD，n=20，下同。Fig. 1 Effects of fluoride exposure on growth and development of R. chensinensis tadpoles on day 25 after fluoride treatment at various concentrationsNote: Asterisk indicate significant difference between the treatments and the control (* P<0.05, ** P<0.01). Bars represent the mean values±SD (n=20). The same below.

圖2 不同濃度F-暴露40 d時對中國林蛙蝌蚪生長和發育的影響Fig. 2 Effects of fluoride exposure on growth and development of R. chensinensis tadpoles on day 40 after fluoride treatment at various concentrations

2.3 F-慢性暴露對中國林蛙G42期蝌蚪形態指標的影響

各處理組G42期蝌蚪形態指標的測量結果見圖4。如圖4所示，經F-慢性暴露后，僅42.8 mg·L-1F-處理組蝌蚪的全長較對照組顯著降低(P<0.01)，而其他各處理組蝌蚪的全長與對照組相比均無顯著變化(P>0.05)；各處理組蝌蚪的體長和后肢長均受到顯著抑制(P<0.05)；此外，4.2 mg·L-1F-和19.4 mg·L-1F-處理組蝌蚪的體重較對照組顯著降低(P<0.05)。

圖3 不同濃度F-慢性暴露對中國林蛙蝌蚪變態率的影響Fig. 3 (A) Time course of cumulative metamorphosis percent (-ln scale) by the Kaplan-Meier analysis in R. chensinensis tadpoles exposed to control and different concentrations of F-(B) Percent metamorphosis of R. chensinensis tadpoles exposed to control and different concentrations of F- at the end of the experiment (on the 78 day)

圖4 不同濃度F-暴露對中國林蛙G42期蝌蚪生長和發育的影響Fig. 4 Effects of fluoride exposure on size of R. chensinensis tadpoles at stage G42 after fluoride treatment at various concentrations

圖5所示為各處理組G42期蝌蚪形態指標比。結果表明，經F-慢性暴露后，與對照相比，0.7 mg·L-1F-和4.2 mg·L-1F-處理組全長/體長顯著增加(P<0.05)，體重/體長則顯著降低(P<0.01)；此外，4.2、19.4、42.8 mg·L-1F-各處理組后肢長/體長均顯著降低(P<0.01)，42.8 mg·L-1F-處理組的體重/后肢長較對照組顯著升高(P<0.05)。

中國林蛙蝌蚪幼體經過78 d的氟離子慢性暴露以后，依據G42期中國林蛙蝌蚪的體長、體重和后肢長等生長指標和變態率為觀察指標。經過統計分析，與對照組相比，0.7 mg·L-1F-處理組的體長和后肢長均受到顯著抑制(P<0.05)。因此，中國林蛙蝌蚪幼體的78 d生長毒性最低可觀察效應濃度(LOEC)為0.7 mg·L-1。

2.4 F-慢性暴露對中國林蛙G42期蝌蚪骨骼發育的影響。

采用改良后的骨骼雙染色方法對中國林蛙G42期蝌蚪進行骨骼染色，經雙染色后的骨骼標本硬骨呈紫紅色，軟骨呈藍色，結果見圖6。如圖6所示：與對照組相比，19.4 mg·L-1F-處理組蝌蚪的副碟骨、喙上骨和額頂骨的骨化程度更好(圖6-4b)，而0.7、4.2和42.8 mg·L-1F-處理組蝌蚪的喙上骨和額頂骨的骨化程度均受到不同程度的抑制(圖6-2b,圖6-3b,圖6-5b)。此外，42.8 mg·L-1F-處理組蝌蚪的脊柱骨化程度受到明顯抑制(圖6-5c)，而其他處理組蝌蚪的脊柱骨化并未發生明顯變化(圖6-2c,圖6-3c,圖6-4c)。

中國林蛙蝌蚪肩帶和前肢主要由肩胛骨、肱骨和橈骨組成。與對照組相比，42.8 mg·L-1F-處理組蝌蚪的肩胛骨、肱骨和橈骨骨化程度受到明顯抑制(圖6-5d)，其他處理組蝌蚪的肩胛骨、肱骨和橈骨骨化程度并未發生明顯變化(圖6-2d,圖6-3d,圖6-4d)。中國林蛙蝌蚪腰帶和后肢主要由髂骨、股骨和脛腓骨組成。0.7、4.2和19.4 mg·L-1F-處理組蝌蚪的髂骨、股骨和脛腓骨的骨化程度并未發生明顯變化(圖6-2e,圖6-3e,圖6-4e)，而42.8 mg·L-1F-處理組蝌蚪的髂骨、股骨和脛腓骨的骨化程度受到一定抑制(圖6-5e)。

圖5 不同濃度F-慢性暴露對中國林蛙蝌蚪G42期形態指標比的影響Fig. 5 Effects of fluoride exposure on body index ratios of R. chensinensis tadpoles at stage G42 after fluoride treatment at various concentrationsNote: (A) The ratio of total length to body length (TL/BL), (B) the ratio of body weight to body length (BW/BL), (C) the ratio of hind-limb length to body length (HLL/BL) and (D) the ratio of body weight to hind-limb length (BW/HLL).

3 討論(Discussion)

動物生長發育的變化是表征污染物毒性效應的重要指標之一。本試驗中，當中國林蛙G12期胚胎經F-慢性暴露25 d時，4.2 mg·L-1F-處理組蝌蚪的全長、體長和體重均較對照組顯著升高，但當暴露時間延長到40 d時，這種促進效應并未延續。我們之前的研究表明，中國林蛙G26期蝌蚪經4.1 mg·L-1F-慢性暴露15 d和30 d時，蝌蚪的生長發育均未受到顯著影響[20]。分析認為，這種差異可能是由于蝌蚪所處發育階段不同，不同生理特性導致了其對化學污染物敏感性的差異[27-28]。此外，本研究中，F-慢性暴露25 d時，僅42.8 mg·L-1F-處理組蝌蚪的全長、體長、體重和發育分期受到顯著抑制，而暴露至40 d時，19.4 mg·L-1F-和42.8 mg·L-1F-處理組蝌蚪的全長、體長、體重和發育分期均受到顯著抑制。我國制定的地表水氟離子環境質量標準為1.5 mg·L-1。由實驗結果可見，在標準范圍內F-暴露濃度對林蛙蝌蚪的生長發育并未造成不利的影響，然而，高于該標準的F-暴露對林蛙蝌蚪的生長發育具有一定的抑制作用。以往的大量研究都表明，氟化物暴露可抑制水生動物的生長發育[29-30]，氟暴露導致的生長抑制可能與機體的代謝功能受到抑制有關[31-32]。

變態是無尾兩棲動物生活史的一個重要環節，變態率的高低直接影響著陸生成體蛙的數量[33]。本研究結果表明，經4.2 mg·L-1F-慢性暴露后，中國林蛙蝌蚪的變態率顯著升高，而19.4 mg·L-1F-和42.8 mg·L-1F-慢性暴露導致中國林蛙蝌蚪變態率的顯著降低。該結果表明，適量的F-暴露能促進兩棲類動物的變態，而過量的F-則抑制兩棲類動物的變態，這與我們之前的報道相一致[19]。但不同兩棲類物種或不同發育階段幼體經F-暴露后，其變態率對F-的響應濃度不同[34]。目前，關于氟離子對兩棲動物變態率的影響機制尚不明確。推測可能由于適量F-有益于動物的生長發育，進而促進了蝌蚪的變態[35]。另外，兩棲動物變態過程是由甲狀腺激素所嚴密調控的[36]，高濃度F-暴露導致蝌蚪變態率的下降可能是由于機體甲狀腺激素的動態平衡受到了干擾[13]。

此外，本研究結果顯示，42.8 mg·L-1F-慢性暴露導致了中國林蛙變態高峰期蝌蚪的全長、體長和后肢長的顯著降低。大量的研究表明，變態個體小的幼體死亡率較高[37-39]，而且個體小的幼體脂肪存量不足，可導致過冬存活率降低及其發育成熟和初次繁殖時間的推遲[40]。另外，42.8 mg·L-1F-處理組變態高峰期蝌蚪的體重與后肢長比值較對照組相比顯著升高，顯然，這將不利于中國林蛙蝌蚪登陸后的跳躍，可能會導致其在自然環境中被捕食風險的增加[41]。這些不利因素都將最終導致兩棲動物種群數量的下降[42]。因而，高濃度F-慢性暴露對中國林蛙蝌蚪變態登陸后的健康具有潛在的不利影響。

兩棲類變態過程中骨骼的骨化是兩棲動物骨骼重構的重要一環，目的是通過增加骨密度來增強支撐能力，從而適應從水生到陸生生活方式的轉變[43]。本研究中，42.8 mg·L-1F-處理組中國林蛙變態高峰期蝌蚪的后肢髂骨、股骨和脛腓骨的骨化程度受到一定的抑制，加之其后肢長也顯著降低，這可能會對中國林蛙蝌蚪的游動能力和登陸之后的跳躍能力造成不利影響[44]。一般認為，骨骼骨化受甲狀腺激素調控[45-46]。Zhao等[13]的研究表明，50 mg·L-1NaF慢性暴露可導致中華大蟾蜍蝌蚪的骨化受到明顯抑制，并指出氟離子可以通過影響脫碘酶基因的表達和甲狀腺濾泡上皮細胞高度等干擾甲狀腺激素的動態平衡，最終導致蝌蚪骨化不完全。

總之，水域氟污染長期脅迫可對中國林蛙蝌蚪的生長發育指標、變態和骨骼骨化造成不利影響，主要表現為高濃度F-水體暴露會顯著抑制蝌蚪的生長發育，并導致變態率下降、變態高峰期個體小、以及蝌蚪骨骼骨化程度的下降。氟離子暴露對這些指標的不利影響可能會造成中國林蛙蝌蚪變態后登陸個體死亡率的增加，最終導致中國林蛙種群數量的下降。