溴化1-丁基-3-甲基咪唑離子液體在空心菜中的吸收積累特性及其毒理效應

米合拜·伊力木拉提， 馬曉利，陳平，努扎艾提·艾比布

新疆師范大學化學化工學院，烏魯木齊 830054

離子液體作為一種新型的“綠色溶劑”[1]，是一類完全由離子組成的室溫熔融鹽。因其具有不易揮發、導電性強、熱穩定性高等特性，其逐漸代替了傳統揮發性有機溶劑[2]，廣泛用于化學和生物反應中。離子液體在廣泛應用的同時會不可避免地被排放到環境中，帶來潛在的生態風險。在2002年首屆Green Solvents For Catalysis國際學術研討會上研究者首次討論了離子液體潛在的毒性。離子液體由咪唑鎓鹽、吡啶鹽、季膦鹽、吡咯鎓鹽、哌啶鎓鹽等陽離子和鹵素及無機酸根陰離子組成，它的毒性取決于陰、陽離子的類型和烷基取代基的長度[3]。研究報道，離子液體在一定程度上對微生物[4-5]、植物[6]、動物[7-8]均有毒害作用。Thamke和Kodam[9]用[C4mim]Br對孔雀魚進行96 h急性毒性實驗，發現孔雀魚細胞膜損傷，抗氧化酶活性增加；Raquel和Carlos[10]報道[C4mim]Br抑制了藻類的生長速率；Chen等[3]和Liu等[11]接連報道咪唑類離子液體抑制小麥、水稻幼苗生長，降低了光合作用的初級反應，停止了光合電子傳遞過程，對植物的生長具有一定的毒性。而有關[C4mim]Br與植物相互作用的研究鮮見報道。

空心菜(IpomoeaaquaticaForsk)是一種一年生植物，其耐受性強，種植成本低，一次栽種可多次收割，可以將吸收的養分和污染物移出水體，常被用于凈化污染水體[12]。國內外學者發現，空心菜能有效地吸收、降解受污染的土壤或水體中的重金屬、持久性有機污染物以及抗生素類污染物[13-15]。本文基于毒理學實驗，以咪唑類離子液體為研究對象，考察了離子液體對空心菜的生長和各項生理生化指標的影響，并研究了空心菜對離子液體的吸收和體內積累特性，旨在為離子液體的環境風險評價提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗藥品與儀器

1.1.1 實驗藥品

次氯酸鈉(5%，阿拉丁試劑有限公司)，溴化1-丁基-3-甲基咪唑(99.0%，上海成捷化學有限公司)，硫代巴比妥酸(98.0%，天津市北聯精細化學品開發有限公司)，氯化三苯基四氮唑(98.0%，上海藍季科技發展有限公司)，甲酸(88%，國藥集團化學試劑有限公司)，甲醇(色譜純，美國西格瑪奧德里奇有限公司)。

1.1.2 實驗儀器

C18分離柱(Agilent Zero Bax SB-C18，2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技有限公司)，高效液相色譜(Agilent 1260，美國安捷倫科技有限公司)，康氏振蕩器(KS型，無錫建儀實驗器材有限公司)，離心機(RG-160AT，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)，旋轉蒸發器(YRE-52C，鞏義市予華儀器有限責任公司)，高效液相色譜(Agilent 1290，美國安捷倫科技有限公司)-三重四級桿串聯質譜(Agilent 6460，美國安捷倫科技有限公司)。

1.2 測定方法

1.2.1 培養方法

供試空心菜品種為竹葉空心菜，種子購于新疆農業科學院，將種子先用5%的次氯酸鈉溶液進行消毒，再在蒸餾水中浸泡12 h后有序地放入含有無菌吸水紙的托盤中，待催芽育苗培養至8 cm高左右時移到150 mL錫箔紙包裹過的三角瓶中，每瓶一株，用1/2霍格蘭營養液適應性培養2周后，選取長勢一致的空心菜將營養液換成分別含0、0.5、1、2、5 mg·L-1[C4mim]Br的全濃度營養液，以5 mg·L-1無植物培養為光降解對照，再以不添加[C4mim]Br (0 mg·L-1)空白植物組作空白對照，并用記號筆標記錐形瓶液位線。每個實驗條件設置3個平行，培養過程中保持連續通氣，光暗比為16 h : 8 h，光照強度2 100～2 500 lux，環境溫度為(26±1) ℃。

1.2.2 毒理學實驗

實驗開始時分別測量每株空心菜的根長、株高以及鮮重，之后每隔3天重復測量一次，用該天測量值減去初始值，求得空心菜生長變化量。用Logistic模型對抑制率-濃度之間的關系進行擬合并計算相應的EC50值。用分光光度法測定葉綠素的含量，單位mg·g-1；用硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛含量，單位nmol·g-1；用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定根系活力[16]，單位mg·g-1·h-1。

1.2.3 [C4mim]Br吸收實驗

實驗過程中，第0、3、6、9、12天用玻璃棒攪勻取0.5 mL水樣，過膜，4 ℃保存。用配備C18分離柱的高效液相色譜測定[C4mim]Br的含量。每天觀察錐形瓶液位線的變化，根據實驗前標記好的高度向錐形瓶用滴管加入一定量的蒸餾水至標記處，以補償蒸發帶來的水消耗。

1.2.4 空心菜體內[C4mim]Br的提取

分別剪去等量鮮重(0.5 g)的空心菜根部和地上部分新鮮樣品，在液氮條件下用陶瓷研缽將樣品碾碎成粉末。將粉末狀植物樣品與8 mL萃取液(0.5%甲酸∶水∶甲醇=1∶1∶1)混勻，劇烈震蕩10 min后置于振蕩器搖動24 h，離心收集上清液，旋轉蒸發至2 mL左右，再用氮氣吹至干燥，最后溶解于1 mL的甲醇，過0.22 μm的濾膜得濾液，采用高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜對萃取液中的[C4mim]Br定量分析。

1.3 數據計算分析

植物富集系數(enrichment coefficients, EC)與轉運系數(translocation factor, TF)，能直觀地表征植物對污染物的吸收與轉運能力[17]，計算公式如下：

富集系數=植物體內污染物積累含量/底物濃度

轉運系數=植物葉片污染物積累含量/植物根部污染物積累含量以上實驗數據均采用3次平行試驗的平均值±標準差，運用SPSS 20.0中的單因素方差分析(One-way ANOVA)對不同濃度[C4mim]Br對空心菜生理生化指標及其吸收累積差異性進行統計分析，并進行LSD顯著性檢驗，用Origin8.5進行繪圖。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 [C4mim]Br對空心菜生長的影響

2.1.1 [C4mim]Br對空心菜根長及株高的影響

植物的根以及株高的變化量是最能直觀表達植物生長狀況的指標。由圖1可知，在整個實驗周期內，空心菜整體的生長隨著培養時間保持著不斷增加的趨勢。空心菜在[C4mim]Br低濃度處理下的生長過程中，根長(圖1A)和株高(圖1B)與空白對照相比，并未受到顯著的抑制(P>0.05)。而在高濃度處理下(2 mg·L-1和5 mg·L-1)，空心菜的這2項生長指標與空白對照相比差異顯著(P<0.05)，在2 mg·L-1和5 mg·L-1的高濃度[C4mim]Br處理下，空心菜的根部的生長量分別占空白對照的80%和71%，株高的生長量分別占空白對照的81%和75%。

圖1 不同濃度[C4mim]Br對空心菜根(A)和株高(B)的影響注：圖中同一天不同字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。Fig. 1 Effect of [C4mim]Br on root length (A) and plant height (B) of Ipomoea aquatica ForskNote: Different letters on the same day indicate significant differences at the level of 0.05, the same below.

圖2 不同濃度[C4mim]Br對空心菜鮮重的影響(A)及空心菜生長抑制率與濃度的關系(B)Fig. 2 Effect of [C4mim]Br on the fresh weight of Ipomoea aquatica Forsk (A), and the relationship between growth inhibition rate and [C4mim]Br concentration (B)

圖3 不同濃度[C4mim]Br對空心菜葉綠素含量的影響Fig. 3 Effect of [C4mim]Br on chlorophyll content of Ipomoea aquatica Forsk

圖4 不同濃度[C4mim]Br對空心菜MDA含量的影響Fig. 4 Effect of [C4mim]Br on MDA content of the Ipomoea aquatica Forsk

圖5 不同濃度[C4mim]Br對空心菜根系活力的影響注：TTC表示氯化三苯基四氮唑。Fig. 5 Effect of [C4mim]Br on the root activity of Ipomoea aquatica ForskNote: TTC stands for triphenyl tetrazolium chloride.

2.1.2 [C4mim]Br對空心菜生物量的影響

由圖2A可知，在實驗中后期(6～12 d)各濃度處理下空心菜生物量的增加量與空白對照差異顯著(P<0.05)。[C4mim]Br處理組濃度由低到高，與空白對照相比空心菜生物量分別減少了8%、12%、29%、41%。生物量變化趨勢與空心菜根及株高變化總體趨勢相一致，再次表明抑制效應具有典型的劑量依賴性。根據生物量計算生長抑制率，用Logistic模型對曲線進行擬合，發現5 mg·L-1[C4mim]Br對空心菜抑制率最高為63%，經[C4mim]Br處理后，空心菜生物量的EC50值為1.64 mg·L-1(圖2B)。

2.2 [C4mim]Br對空心菜生理學指標的影響

2.2.1 [C4mim]Br對空心菜葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進行光合作用的色素，葉綠素含量的高低在一定程度上反映了光合作用水平的高低。由圖3可知，隨著培養時間的延長空白對照組中葉綠素含量變化不顯著，而不同濃度的[C4mim]Br處理組中葉綠素a和葉綠素b的含量卻在不斷下降，并且隨[C4mim]Br濃度升高下降趨勢越明顯。實驗初期高濃度處理下(5 mg·L-1)空心菜葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量分別占對照組的88%和91%，而到實驗末期僅占對照的54%和64%。葉綠素的含量與[C4mim]Br處理濃度呈顯著負相關(Rchl a= -0.890，Rchl b= -0.885，P<0.05)。

2.2.2 [C4mim]Br對空心菜葉片MDA含量的影響

MDA是膜質過氧化的最終產物，MDA含量的高低可以表示細胞膜損傷程度。本研究發現，空心菜葉片中MDA含量隨[C4mim]Br濃度的升高而增加(圖4)，低濃度處理時MDA含量有小幅度的增加，但高濃度[C4mim]Br處理時空心菜體內MDA含量急劇增加，與空白對照組有顯著差異(R= 0.949，P<0.05)。通過12 d處理后，在[C4mim]Br處理濃度為0.5 mg·L-1時，MDA含量從空白對照組的26 nmol·g-1增加到38 nmol·g-1，在[C4mim]Br處理濃度為5 mg·L-1時，空心菜體內MDA含量達到最高，是空白對照的4倍。

2.2.3 [C4mim]Br對空心菜根系活力的影響

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部的營養狀況，根系活力越高植物生長越旺盛。由圖5可知，空心菜根系活力隨[C4mim]Br濃度的升高呈顯著負相關(R=-0.903，P<0.05)。在實驗初期，在0.5 mg·L-1[C4mim]Br處理中，空心菜根系活力與空白對照無顯著差異(P>0.05)，其余處理濃度均顯著低于對照組(P<0.05)。隨著時間的推移，不同濃度的[C4mim]Br處理的空心菜根系活力均出現逐漸下降的趨勢，經12 d處理[C4mim]Br處理濃度由低到高與對照的差異都顯著(P<0.05)，并且僅占空白對照的85%、82%、53%、42%。

2.3 空心菜對[C4mim]Br的吸收

由圖6可見，在整個實驗過程中，水體中的[C4mim]Br含量可能受到空心菜根系的吸收、離子液體的光降解以及容器的吸附等綜合作用，從而引起其濃度的下降。通過前期實驗，確定容器的吸附作用可忽略不計。無植物栽培的5 mg·L-1[C4mim]Br的光解對照實驗表明，在本實驗條件下，水體中[C4mim]Br的光降解可忽略，因此[C4mim]Br濃度的降低以空心菜的吸收為主。經12 d處理后，空心菜對0.5、1、2、5 mg·L-1[C4mim]Br吸收分別為9%、7.8%、6.8%、5.6%；而前3天吸收分別為5.4%、4.3%、3%、2.4%，占到了所吸收量的60%、55%、44%、42.8%。結果顯示[C4mim]Br濃度越高，空心菜吸收率越低的趨勢，而污染物濃度過高會引起植物根細胞膜的破壞，從而影響植物根系對污染物的吸收。隨著培養時間的延長和處理濃度的升高，[C4mim]Br對空心菜的毒性作用加強，空心菜根系細胞膜受損程度嚴重，進而抑制了空心菜對[C4mim]Br的吸收。

2.4 [C4mim]Br在空心菜體內的積累特性

在不同濃度[C4mim]Br處理12 d的過程中，每隔3天分別收集空心菜根部和地上部分，并檢測不同組織內部積累的[C4mim]Br濃度。結果表明空心菜可以通過根部吸收[C4mim]Br，并轉運至空心菜的地上組織。當處理濃度為5 mg·L-1時，根部積累量為27.92 μg·g-1FW，地上部分積累量為12.08 μg·g-1FW，根部對[C4mim]Br積累量是地上部分積累量的2.3倍(圖7)。[C4mim]Br在根部和葉片中的積累量與濃度呈顯著性正相關(R=0.951，P<0.05)，并且實驗前3天的植物總積累量是實驗結束時植物總積累量的38%，隨著時間的推移，相同濃度處理下，雖然空心菜體內[C4mim]Br積累量在增加，但是增加幅度減弱，而富集系數與轉運系數是衡量空心菜對[C4mim]Br吸收和轉運能力的重要指標，本實驗中空心菜對[C4mim]Br的富集系數(表1)與空心菜吸收[C4mim]Br的特性相吻合，在0.5～5 mg·L-1濃度范圍內逐漸降低，并且空心菜的富集系數與轉運系數均小于1，說明空心菜對[C4mim]Br的吸收能力較弱。

圖6 空心菜對不同濃度[C4mim]Br的吸收Fig. 6 Uptake of [C4mim]Br by Ipomoea aquatica ForskNote:C stands for measured concentration; C0 stands for initial concentration.

表1 空心菜對不同濃度的[C4mim]Br的富集系數和轉運系數Table 1 Enrichment coefficients and translocation factors of [C4mim]Br in different parts of Ipomoea aquatica Forsk

注：表中同一列不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

Note: Different letters in the same column indicate significant differences at the level of 0.05.

圖7 不同濃度[C4mim]Br在空心菜不同部位的積累含量Fig. 7 Accumulation of [C4mim]Br in different parts of Ipomoea aquatica Forsk

3 討論(Discussion)

植物受到外來污染物的脅迫后會出現生長緩慢、葉片變黃等毒害癥狀。毒理學實驗的結果能直觀反映植物對外來污染物毒性的耐受能力[18]。本研究顯示，隨著[C4mim]Br濃度的不斷增加，空心菜根部變為褐色，根長以及株高的生長緩慢，空心菜各生長指標受到明顯的抑制。前人研究報道在玉米種子幼苗的生長過程中，隨[C8mim]Br濃度提高，玉米植株受到抑制，這與本研究的結果相一致[19]。[C4mim]Br對空心菜的半最大效應濃度(EC50)值低于Matzke等[20]報道的對浮萍的半最大效應濃度，表明[C4mim]Br對空心菜的毒性相對較高。

葉綠素是植物光合作用的基礎，植物葉片中葉綠素含量的高低可以間接表明植物是否受到有毒化合物的傷害[21]。本研究結果表明，隨著時間的推移，葉綠素含量逐漸降低，說明隨著離子液體處理時間和濃度的增加，離子液體破壞空心菜體內的葉綠體結構，降低葉綠素的合成量。Liu等[11]報道經咪唑氯鹽類離子液體處理后，水稻葉綠素熒光從橙色變為黃色然后變為淺綠色，表明離子液體能夠損傷水稻葉綠體類囊體。而類囊體膜是植物葉綠體光能吸收、傳遞和轉換的基礎結構，光合色素是類囊體膜的重要組成部分，因而當植物葉綠素a、b的含量下降時，從形態上觀察植物會出現退綠、黃化等現象[22]。與本實驗中空心菜葉片變黃相吻合。

植物在逆境環境中，體內的活性氧自由基會迅速積累，原有的活性代謝會失衡，膜脂質過氧化作用啟動[23]，MDA含量增加，因此MDA含量的高低可以直接反映植物抗逆境生長能力的強弱。4個濃度的[C4mim]Br處理下，空心菜葉片中MDA的含量隨[C4mim]Br的濃度升高而增加，可能是空心菜體內自由基累積，加劇了膜脂質過氧化過程，致使細胞膜結構和功能受到了嚴重損傷。

植物的根是抵御外來污染物入侵的第一道防線，植物健壯的根系呼吸作用強，其脫氫酶活力強；相反，當植物受到外界環境脅迫時，呼吸作用減弱，脫氫酶活力降低。根系活力的高低可以反映出植物抵御外界脅迫能力的高低[24]。在植物體內中，根系活力與根系質膜透性呈負相關[25]，本研究中[C4mim]Br抑制了空心菜的根系活力，因此可能根系質膜透性增大使細胞受到傷害，改變根系細胞膜的蛋白質成分，從而誘導蛋白質結構損傷，增加膜質過氧化速率，破壞細胞膜。此外，隨著離子液體烷基側鏈的增加會傾向于具有更強的疏水性，因而會增加其與細胞膜脂質雙分子層和疏水性蛋白相互作用的可能[26]，從而使根系對其生長所需營養和其他離子如離子液體的吸收、轉運能力下降[27]。

富集系數與轉運系數能綜合地反應空心菜吸收并在體內轉移[C4mim]Br的能力，而離子液體化學穩定性強、難生物降解并且具有低揮發性，導致其進入生物體后較難以快速被生物降解或隨葉片呼吸作用揮發到大氣中，因此較易積累在植物體內。我們的實驗結果表明空心菜對[C4mim]Br的富集系數小于1，空心菜并不是超積累植物。[C4mim]Br在根部的積累量是地上部分的2.3倍，根系是[C4mim]Br進入空心菜體內的首要門戶，是[C4mim]Br的主要積累器官[28]。一般污染物進入植物根細胞后，會從植物的根部遷移擴散到植物地上組織，植物根部吸收了[C4mim]Br后，受木質部汁液的分布和細胞膜滲透率的影響，向體內其他部位遷移擴散[29]。細胞質膜呈負電性，這易于植物吸收[C4mim]+等陽離子[30]。植物吸收[C4mim]Br主要受根部質外體向凱氏帶的水流動力驅動，最終轉運至木質部汁液。化合物在水中和在富含脂質的細胞膜中的溶解性決定了其向根中遷移并隨后轉移至葉片的能力[31]。然而，由于離子液體親水性極高，[C4mim]Br向植物內皮親脂細胞膜的遷移過程十分緩慢，最終導致遷移效率的下降[32]。所以[C4mim]Br向空心菜地上組織中的遷移效率相對比較低，轉運系數較小。

總而言之，在本研究中經過不同濃度的[C4mim]Br處理后，空心菜的生長和生理指標均受到了抑制，隨著[C4mim]Br處理濃度的增加，空心菜生長變慢，葉片變黃，植株矮小，根系不發達，空心菜生物量、葉綠素含量和根系活力均下降，同時MDA含量增加。[C4mim]Br能被空心菜吸收進入體內，由于[C4mim]Br處理濃度越高對空心菜的毒害作用越強，導致空心菜吸收離子液體的能力隨濃度的增加而下降。[C4mim]Br在空心菜根部的積累遠大于在葉片內的積累，并且各部分含量隨著[C4mim]Br處理濃度的升高而不斷增加，由此可知，空心菜從根部吸收的離子液體會通過植物本身的運輸作用，將[C4mim]Br運輸至空心菜的地上部分。同時，本研究證實了離子液體并不完全是“綠色”化學品，環境水體中的[C4mim]Br離子液體可以利用空心菜的生長從根部進入到空心菜的其他部分中，它有通過食物鏈進入人體的可能性，需要研究者對其環境安全性進行更加全面的評估。